牛奶中硝基咪唑類藥物的測定

文/賈 濤

（北京市飼料監(jiān)察所）

牛奶中硝基咪唑類藥物的測定

文/賈 濤

（北京市飼料監(jiān)察所）

牛奶樣品經(jīng)乙酸乙脂提取、正己烷去脂、MCX凈化小柱凈化后過膜，注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測儀。試驗顯示：濃度為0、2.0、4.0、20.0、40.0、200.0、400.0 ng/mL標準曲線相關(guān)系數(shù)R2值均大于0.995；回收率為86.7%～89.2%，變異系數(shù)小于15%，試驗結(jié)果表明該方法能夠達到靈敏度、準確度和精密度的要求。

牛奶；硝基咪唑；測定分析

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑?qū)φ掌罚杭兌炔恍∮?5%。甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羥基甲硝唑-D2、羥基地美硝唑-D3對照品：純度不小于95%。乙酸乙酯（色譜純），乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），鹽酸（優(yōu)級純），正己烷（分析純），氨水（分析純），甲酸（色譜純）。

1.2 溶液配制

1.2.1 鹽酸溶液

鹽酸溶液（0.1 mol/L）：取8.3 mL濃鹽酸，加水稀釋定容至1 000 mL，混勻。

1.2.2 標準儲備液

標準儲備液（1 000 μg/mL）：分別稱取適量的甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑?qū)φ掌罚眉状既芙馀渲瞥? 000 μg/mL的標準儲備液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 混合標準儲備液

混合標準儲備液（10 μg/mL）：分別準確量取0.1 mL甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥基地美硝唑標準儲備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 混合標準工作液

取適量的10 μg/mL的混合標準儲備液，用甲醇稀釋成適宜濃度的標準工作液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.5 內(nèi)標儲備液

內(nèi)標儲備液（1 000 μg/mL）：分別稱取適量的甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羥基甲硝唑-D2、羥基地美硝唑-D3對照品，用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的內(nèi)標儲備液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.6 混合內(nèi)標儲備液

混合內(nèi)標儲備液（10 μg/mL）：分別準確量取0.1 mL甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羥基甲硝唑-D2、羥基地美硝唑-D3內(nèi)標儲備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.7 混合內(nèi)標工作液

混合內(nèi)標工作液（0.1 μg/mL）：準確量取0.1 mL混合內(nèi)標儲備液（10 μg/mL）至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.3 儀器及設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源），天平（感量0.01 g和0.00001 g），高速冷凍離心機，渦旋混合器，固相萃取裝置，氮吹儀，濾膜（0.2 μm），MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL）。

2 測定

2.1 樣品前處理

稱取（2.00±0.02）g牛奶試樣于50 mL離心管中，添加100 μL 0.1 μg/mL內(nèi)標工作液，渦動30 s混勻，靜置10 min。加15 mL乙酸乙酯，渦動2 min，10 000 r/min離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，殘渣用15 mL乙酸乙酯重復提取一次，合并兩次提取液，20 ℃水浴氮氣吹干。加0.1 mol/L鹽酸5 mL，渦動1 min充分溶解殘渣，加5 mL正己烷，手搖20 次，5 000 r/min離心5 min，棄正己烷層。下層再加5 mL正己烷重復去脂一次，除盡正己烷層，備用。MCX固相萃取柱依次用2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L鹽酸活化，取備用液全部過柱，再依次用2 mL 0.1 mol/L鹽酸、1 mL甲醇、1 mL 2%氨水淋洗，用2 mL甲醇-水-氨水（80%-15%-5%）洗脫。洗脫液20 ℃水浴氮氣吹干，0.5 mL水渦動1 min復溶，過濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.2 液相色譜條件

色譜柱：C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液。

要實施環(huán)境影響評價法，就要加大對違法行為的處罰力度。對于施工時破壞環(huán)境的企業(yè)不僅要交罰金，還要讓他們停止施工。對于排放污染物出現(xiàn)超標問題，要根據(jù)相關(guān)規(guī)定進行處罰，同時不審批環(huán)境影響評價。

流速：0.3 mL/min。

柱溫：30 ℃。

進樣量：10μL。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

表2 定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量

表3 硝基咪唑標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2值）

2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源。

檢測方式：多反應監(jiān)測。

電離電壓：3.0 kV。

源溫：100 ℃。

霧化溫度：350 ℃。

錐孔氣流速：30 L/h。

霧化氣流速：600 L/h。

定性、定量離子及對應的錐孔電壓、碰撞能量見表2。

3 試驗設(shè)計

3.1 標準曲線

制備一系列牛奶基質(zhì)匹配標準溶液，濃度為0、2.0、4.0、20.0、40.0、200.0、400.0 μg/L，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得出的回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2值）見表3。

3.2 靈敏度

以3 倍信噪比為檢測限，10 倍信噪比為定量限，該方法的檢測限和定量限分別能達到0.5μg/kg和1.0 μg/kg。

3.3 準確度和精密度

將硝基咪唑標準溶液添加到不同空白牛奶中，使樣品中硝基咪唑類藥物濃度為定量限（1.0 μg/kg），按樣品處理方法提取、凈化，然后進行LC-MS/MS分析。批內(nèi)進行5 個重復，批間進行3 批次試驗。用內(nèi)標法計算回收率，批內(nèi)、批間變異系數(shù)見表4。

表4 牛奶中硝基咪唑類藥物濃度定量限位1.0μg/kg添加的回收結(jié)果

4 結(jié)論

硝基咪唑在牛奶中的回收率為86.7%～89.2%，變異系數(shù)小于15%，試驗結(jié)果表明，該方法能夠達到靈敏度、準確度和精密度的要求。

2017-06-15）

賈濤，北京市飼料監(jiān)察所，高級畜牧師，理化檢驗室檢驗員，質(zhì)量監(jiān)督員，從事飼料與生乳檢測、調(diào)研及質(zhì)量監(jiān)督工作。