貝那普利和氨氯地平對自發性高血壓大鼠酪酪肽表達的影響

金 華 劉志軍 顏春魯 劉峰林 陳 麗 張秋菊 徐厚謙 胡繼宏 竇榮海 溫鑫洋

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

貝那普利和氨氯地平對自發性高血壓大鼠酪酪肽表達的影響

金 華 劉志軍 顏春魯 劉峰林 陳 麗 張秋菊 徐厚謙 胡繼宏 竇榮海 溫鑫洋

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

目的探討貝那普利和氨氯地平對自發性高血壓大鼠(SHR)酪酪肽(PYY)表達的影響。方法14周齡雄性SHR 45只隨機分為模型組(n=15)、貝那普利組(鹽酸貝那普利灌服0.90 mg·kg-1·d-1，n=15)、氨氯地平組(苯磺酸氨氯地平灌服0.45 mg·kg-1·d-1，n=15)，以同源雄性WKY大鼠作為正常對照(n=15)，模型組及WKY 組每日灌服同體積的蒸餾水，干預8 w后，應用酶聯免疫法檢測血清中PYY的含量，采用免疫組化法和RT-PCR法分別檢測結腸中PYY及其mRNA的表達。結果干預8 w后，模型組血清中PYY及其mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，各給藥組血清中PYY及其mRNA表達無顯著性差異(P>0.05)；與WKY組比較，模型組結腸組織中PYY及其mRNA表達顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，貝那普利組與氨氯地平組結腸組織中PYY及其mRNA表達降低(P<0.05)，與貝那普利組比較，氨氯地平組結腸組織中PYY及其mRNA表達顯著降低(P<0.05)。結論SHR大鼠結腸組織中PYY調節失衡，貝那普利、氨氯地平的降壓作用很可能還通過調節PYY的表達而達到降壓目的。

自發性高血壓大鼠；酪酪肽；貝那普利；氨氯地平

酪酪肽(PYY)是由36個氨基酸組成的小分子多肽，主要分布在腸道遠端的內分泌L-細胞，是一種重要的胃腸激素類腦腸肽。PYY3-36是PYY的主要存在形式，PYY可自由通過血腦屏障與下丘腦弓狀核Y2受體結合〔1〕。然而，有關PYY這一高相關胃腸激素在高血壓發病過程中的變化及ACEI、CCB等藥物對其的影響尚無實驗研究。本實驗擬分析自發性高血壓大鼠(SHR)PYY的表達。

1 材料與方法

1.1動物 14周齡SPF級雄性SHR 45只，體重(350±20)g；同源雄性 WKY大鼠15只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物實驗室(恒溫22℃±2℃，恒濕55%±5%，人工光照明暗各12 h)。

1.2實驗分組及干預 45只SHR常規飼養7 d后，隨機分為模型組、貝那普利組、氨氯地平組各15只；同時以WKY大鼠15只作為正常對照組。以蒸餾水為溶劑配制貝那普利和氨氯地平混懸液，貝那普利組灌服貝那普利0.90 mg·kg-1·d-1；氨氯地平組灌服氨氯地平0.45 mg·kg-1·d-1。模型組及正常對照組每日灌服同體積的蒸餾水。共干預8 w。實驗過程中由于灌胃不當等原因導致個別動物死亡。

1.3藥物、試劑和儀器 鹽酸貝那普利(洛汀新，10 mg，北京諾華制藥有限公司，批號：X1936)，苯磺酸氨氯地平(絡活喜，5 mg，輝瑞制藥有限公司，批號：1205120)。PYY酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號20130402B)。PYY一抗，批號為：ab15879，Lot：147843-1；Goat anti-Rabbit IgG(H+L)，ab6702；上述均購置于美國abcam公司。免疫組化染色試劑盒購置于武漢博士德生物工程有限公司。RNA提取試劑盒(QIAGEN公司，批號74104)，反轉錄試劑盒(Roche公司)、熒光染料(Roche公司)、PCR引物(金唯智生物科技有限公司設計合成)、全自動酶標分析儀(Bio-Rad公司，型號iMark)、熒光PCR儀(Bio-Rad公司，型號CFX96)、凝膠掃描成像系統(Bio-Rad公司)、電子天平(上海精密科學儀器有限公司，型號FA2004N)、醫用低速離心機(金壇市恒豐儀器廠，型號LX-820)等。

1.4取血 末次給藥24 h后，并禁食 10 h(過夜)，次日測量所有大鼠的體質量，隨后腹腔注射10%的水合氯醛(1.5 ml/100 g體質量) 麻醉大鼠，腹主動脈采血5 ml，4℃ 3 500 r/min(半徑7 cm)離心15 min，分離血清，-20℃保存，待測。

1.5血清中PYY含量的檢測 用ELISA檢測血清中PYY的含量，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作。批內變異系數為8.5%，批間變異系數為13.5%。

1.6免疫組化法測定結腸中PYY的表達 取部分結腸組織，作適當的修整后放入4%多聚甲醛中固定。①石蠟切片：40℃過夜，60℃烤片1 h；②常規脫蠟至水；③抗原修復：枸櫞酸緩沖液(pH6.0)恒溫水浴至95℃～98℃，放入玻片，維持60 min；室溫放置自然冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次；④滴加內源性過氧化物酶封閉液，避光室溫孵育10 min；PBS沖洗5 min×3次；⑤封閉：滴加正常山羊血清，37℃孵育15 min，甩干不洗；⑥滴加稀釋5-HT抗體，然后4℃過夜。用PBS替代一抗作為陰性對照，約12～16 h；次日取出，室溫放置10 min，PBS洗5 min×3次；⑦滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS洗5 min×3次；⑧滴加HRP標記的鏈霉親和素，37℃孵育15 min；PBS洗5 min×3次；⑨DAB顯色：DAB按試劑說明書配置，鏡下觀察，至目的組織出現陽性顆粒而周圍組織無非特異顯色時，蒸餾水終止；⑩蘇木素復染細胞核1～2 min，1%鹽酸乙醇分化數秒，鏡下控制，自來水返藍10 min；脫水、透明、封片。

1.7RT-RCR法測定結腸中PYY mRNA表達 ①總RNA的提取：取30 mg組織提取總RNA，液氮速凍后碾磨組織，加入600 μl RLT裂解液裂解組織，將所得溶液于離心機4℃、12 000 r/min(半徑7 cm)離心3 min；加入70%乙醇600 μl后，立即轉移700 μl溶液(包括沉淀)至柱子上，離心15 s，完全濾過溶液；分別加入700 μl Buffer RW1、500 μl Buffer RPE，按上述條件離心，棄濾液，加入500 μl Buffer RPE離心2 min，棄濾液；將柱子移入至新的2 ml試管中，離心1 min干燥濾膜，將柱子移入之新的1.5 ml試管中加入30～50 μl無酶水，離心1 min得到RNA；同時取2 μl RNA樣品稀釋50倍后測定樣品在260 nm和280 nm的吸收值，OD260/280 在1.8～2.0視為提取的總RNA質量純度較好。② 逆轉錄獲得第一鏈cDNA：使用羅氏反轉錄試劑盒(No 0489686-6001)，嚴格按照說明書進行反轉錄總mRNA，合成第一鏈cDNA文庫，反應產物在-20℃冰箱中保存備用。反應條件：25℃、10 min，55℃、30 min，85℃、5 min，4℃保存。引物設計與合成：β-actin：正義：3′AGGGAAATCGTGCGTGAC5′，反義：3′CGCTCATTGCCGATAGTG5′；PYY：正義：3′CTGCGCCACTACCTCAAVVT5′，反義：3′TCTCGCTGTCGTCTGTGAAGA5′。③cDNA的PCR擴增：使用FastStart Universal SYBR Green MASTER(ROX)，實驗步驟參照其說明書，采用總體積50 μl反應體系，反應條件：95℃、5 min，95℃、10 s，55℃、20 s，75℃、30 s。實驗重復3次。采用2-△△CT法做相對定量分析。

1.8統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1血清中PYY含量的變化 與正常對照組(0.74±0.03)比較，模型組PYY血清濃度(0.80±0.07)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組(0.82±0.05)和氨氯地平組(0.79±0.08)無顯著差異(P>0.05)。

2.2PYY在結腸中的表達 PYY在各組大鼠的結腸中均有表達。與正常對照組(81.15±0.35)比較，模型組PYY的表達(94.89±0.83)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組和氨氯地平組(97.13±0.30，82.38±0.87)明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，氨氯地平組明顯降低(P<0.05)。鏡下觀察顯示，PYY在黏膜下腺體上皮細胞的胞質中表達較弱，而在黏膜層底部表達增強，正常對照組PYY在黏膜層底部表達較弱，模型組PYY在黏膜層底部表達增強，貝那普利組和氨氯地平組PYY在黏膜層底部表達減弱，而氨氯地平組的表達減弱更顯著，見圖1。

2.3PYY mRNA在結腸中的表達 與正常對照組(0.27±0.07)比較，模型組PYY mRNA在結腸中的表達(1.00±0.32)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組和氨氯地平組(0.92±0.09，0.31±0.09)表達明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，氨氯地平組表達降低(P<0.05)。

2.4PYY 在結腸中的蛋白表達 PYY蛋白在WKY組結腸組織中處于低表達狀態。與正常對照組(0.68±0.02)比較，模型組結腸組織中PYY蛋白表達(1.04±0.05)升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組和氨氯地平組(0.89±0.03，0.76±0.04)蛋白表達降低(均P<0.05)；與貝那普利組比較，氨氯地平組蛋白表達降低(均P<0.05)。見圖2。

圖1 各組大鼠結腸中PYY表達(免疫組化染色，×400)

圖2 各組大鼠結腸中PYY蛋白表達的影響

3 討 論

研究表明，胃腸激素是消化系統和心血管的一類重要調節因子，胃腸激素調節異常可能是高血壓發病的重要因素〔2〕。胃腸激素通過“迷走傳入神經-孤束核”將信號傳導至下丘腦弓狀核，進而參與食物攝入和能量平衡的調節〔3，4〕。PYY是含有 36 個氨基酸的直鏈多肽類物質，是一種重要的胃腸激素。PYY主要有PYY1-36和PYY3-36兩種類型，而PYY3-36是血液循環中的主要存在形式〔5〕。PYY作為一種調節肽，通過位于靶細胞的PYY受體向組織細胞內傳遞信息〔6〕。研究發現〔7〕，迷走神經、腦干介導的通路通過PYY3-36 而發揮調節作用，Y2 受體就位于迷走傳入神經的終端，如果腹部切斷迷走神經或者橫斷丘腦-后腦將會抑制 PYY 的減食欲作用，下丘腦將不會被激活。而由十二指腸注入食物時，在營養素抵達PYY生成的主要部位—腸道遠端之前，血漿PYY水平就已升高，提示PYY的釋放可通過神經反射—迷走神經反射引起〔8〕。PYY參與營養、攝食、能量平衡的調節〔9〕，是一個調節攝食的飽感信號〔10〕。本實驗通過ELISA檢測血清中PYY的含量，結果顯示，與WKY組比較，模型組大鼠血清中PYY含量表達升高，SHR大鼠血清中PYY表達含量升高，這可能與血壓升高相關。

貝那普利和氨氯地平均具有良好的降壓作用，而且在降壓的同時能有成效逆轉血管重構〔11，12〕。但關于二者對“胃腸激素-酪酪肽”表達的影響，目前尚未見相關研究文獻。本實驗結果提示，氨氯地平可使SHR結腸中PYY mRNA的表達降低，進而達到降壓的目的。從而推測，SHR大鼠結腸組織中PYY調節失衡，氨氯地平的降壓作用很有可能是通過調節“胃腸激素-酪酪肽”的的表達，最終降低血壓。

高血壓的發生是多因素影響的結果，而遺傳易感性和環境因素可能通過胃腸激素影響血壓調控。“胃腸激素-酪酪肽”的研究從一個全新的角度對高血壓的發病機制進行探索，而胃腸激素可能是影響血壓調控的重要因素之一。研究胃腸激素與高血壓的相關性，可能是對高血壓發病機制中的神經、體液調節的一項重要補充，但氨氯地平和貝那普利通過調節胃腸激素降低血壓的具體作用機制及途徑還有待更深入地研究。

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〔2016-12-11修回〕

(編輯 李相軍)

R544

A

1005-9202(2017)19-4717-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.012

國家自然科學基金資助項目(81160477)；甘肅省自然科學研究基金計劃( 1107RJZA220)；甘肅省高等學校基本科研業務費資助項目(2010-5)

金 華(1970-)，男，教授，主任醫師，博士，主要從事心腦血管疾病及其危險因素的臨床與實驗研究。