解毒通絡方抑制異丙腎上腺素誘導心肌損傷大鼠的膠原合成

王景妍 王博宇 尹延麗 曦 巖 郭家娟 李相軍

(長春中醫藥大學臨床醫學院，吉林 長春 130116)

解毒通絡方抑制異丙腎上腺素誘導心肌損傷大鼠的膠原合成

王景妍1王博宇1尹延麗1曦 巖1郭家娟1李相軍2

(長春中醫藥大學臨床醫學院，吉林 長春 130116)

目的觀察解毒通絡方對異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷后膠原合成的干預作用。方法成年Wistar雄性大鼠隨機分為對照組、模型組、解毒通絡方高、中、低劑量組和ACEI組。解毒通絡方組給予解毒通絡方沖劑懸液10、20、30 g/kg灌胃，ACEI組給予卡托普利水溶液0.005 g/kg灌胃，對照組和模型組均給予生理鹽水灌胃。7 d后，ELISA法檢測各組大鼠血漿血管緊張素(Ang)Ⅱ含量；堿水解法測定心肌組織羥脯氨酸(Hyp)含量；免疫組化方法檢測心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ和TGF-β1表達。結果與對照組比較，模型組血清 AngⅡ含量及心肌Hyp含量均明顯升高(P<0.05)，心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ及TGF-β1蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，解毒通絡方各劑量組血清 AngⅡ含量及心肌 Hyp 含量均降低(P<0.05)，心肌Col Ⅰ、Col Ⅲ和TGF-β1蛋白表達明顯減少(P<0.05)；與ACEI組比較，解毒通絡方高劑量組TGF-β1蛋白的陽性表達面積減少(P<0.05)。結論解毒通絡方可以有效抑制異丙腎上腺素所致的大鼠心肌膠原合成，其機制可能與抑制AngⅡ生成及干擾心肌TGF-β1信號通路有關。

心肌損傷；膠原；血管緊張素Ⅱ；TGF-β1；解毒通絡方

心肌纖維化(MF)屬于中醫學的“心悸”“胸痹”“怔忡”“痰飲”等范疇，是指心肌組織中的膠原纖維過量沉積，膠原容積分數和膠原濃度顯著增加，各型膠原比例失調以及排列紊亂，可導致心室順應性下降，影響心臟的正常收縮與舒張，是多種常見心臟疾病走向終末期心臟病發展的一個必然過程，是心功能由代償期向失代償期轉變的關鍵〔1〕。阻止或逆轉心肌纖維化是延緩心力衰竭、減少心律失常發生的重要手段〔2〕。檢測心肌組織中膠原濃度和膠原容積是界定心肌纖維化的金標準。目前認為，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)的激活是導致心肌纖維化的主要因素，而血管緊張素(Ang)Ⅱ是RAAS中起主要生物學效應的物質〔3〕。靳宏光等〔4〕發現解毒通絡方中的藥物有降低AngⅡ的作用。AngⅡ可刺激轉化生長因子(TGF)-β1表達，也可刺激體外培養的大鼠新生心肌成纖維細胞促進對TGF-β1的旁分泌而致心肌肥大〔5〕。本研究進一步探討解毒通絡方對心肌纖維化初期膠原合成的干預作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 解毒通絡方(夏枯草顆粒劑、牛膝顆粒劑和茺蔚子顆粒劑，均由長春中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供)；卡托普利(25 mg/片，杭州民生藥業有限公司，批號：T15H048)；鹽酸異丙腎上腺素(Sigma-adrich，批號：1351005)；一步法聚合物檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：16G76D07)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：K152317J)；羥脯氨酸試劑盒(堿)(南京建成生物工程研究所，批號：KGT030-2)；大鼠AngⅡ ELISA試劑盒(上海美軒生物科技有限公司，批號：MEXN-R1019)。

1.2主要儀器 FAIO04電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)、OlympusDX40光學顯微鏡(日本Olympus公司)、光學顯微照相系統(日本Olympus公司)、酶聯免疫檢測儀(華東電子集團醫療裝備有限責任公司)、可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.3實驗動物及分組 將 30只特殊清潔級(SPF)雄性 Wistar 大鼠(體重180～200 g，由吉林大學醫學院動物實驗中心提供)隨機分為對照組、模型組、解毒通絡方低劑量組、中劑量組、高劑量組及血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)組。除對照組外，其余各組均行鹽酸異丙腎上腺素腹腔注射(5 mg/kg 體重)，以復制大鼠心肌纖維化模型。造模當天，解毒通絡方高、中和低劑量組大鼠按相應劑量(30、20、10 g/kg)灌胃給藥，ACEI組大鼠灌服卡托普利水溶液(0.005 g/kg)，其余各組灌服等體積生理鹽水。于造模后7 d處死大鼠，取心臟進行相關指標檢測。

1.4血清AngⅡ檢測 按ELISA試劑盒使用說明書進行血清 AngⅡ檢測，主要步驟：①每凹孔加入50 μl用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的心肌組織標本，對照孔加蒸餾水50 μl，30℃作用30 min。②洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗5次，每次1 min。③各孔加入50 μl辣根過氧化物酶標記的檢測抗體溶液，對照孔不加，37℃作用30 min。④洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗5次，每次1 min。⑤所有孔加入底物A，B各50 μl，37℃避光孵育10 min。⑥每孔加終止液50 μl。⑦觀察記錄結果：用酶標儀在450 nm波長下測量OD值。

1.5心肌組織羥脯氨酸(Hyp)測定 取100 mg心尖心肌組織，用堿水法，按照試劑盒說明，在λ=550 nm 波長處用分光光度法測定心肌組織Hyp的含量，所得值/0.134即為心肌中膠原蛋白的含量。

1.6觀察心肌Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)和TGF-β1蛋白的表達 采用免疫組化方法，切片置于二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ15 min，無水酒精，95%、85%、75%酒精各2 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，微波爐抗原修復(枸櫞酸鉀液為抗原修復液)，冷卻至室溫，PBS浸泡5 min反復3次，3% H2O2去離子水孵育5 min，滴加一抗(Col Ⅰ、Col Ⅲ，稀釋度均為1∶100；TGF-β1稀釋度均為1∶200)，4℃過夜；PBS 浸泡5 min反復3次，每張切片滴加生物素化二抗(PV-6000山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物)，37℃恒溫孵育20 min，DAB 鏡下觀察顯色；反應結束后光學顯微鏡下觀察染色，陽性染色結果顯示為細胞質的棕黃色顆粒；蘇木素復染、脫水、透明封片后鏡下檢測。采用Image J圖像分析，測量陽性表達面積均值。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0軟件行方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)。

2 結 果

2.1解毒通絡方對大鼠血清AngⅡ含量的影響 模型組血清 AngⅡ含量明顯高于對照組(P<0.05)，解毒通絡方各劑量組血清 AngⅡ含量明顯低于模型組(P<0.05)，解毒通絡方各劑量組與ACEI組無明顯差異(P>0.05)，見表 1。

2.2解毒通絡方對大鼠心肌組織Hyp含量的影響 模型組心肌組織Hyp含量明顯高于對照組(P<0.05)，解毒通絡方低、中劑量組心肌組織Hyp含量明顯低于模型組(P<0.05)，解毒通絡方各劑量組與ACEI組無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.3解毒通絡方對心肌膠原蛋白表達的影響 模型組Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白的陽性表達面積值均明顯高于對照組(P<0.05)，而解毒通絡方低、中劑量組Col Ⅰ蛋白的陽性表達面積值低于模型組(P<0.05)，解毒通絡方中、高劑量組Col Ⅲ蛋白的陽性表達面積值低于模型組(P<0.05)，而Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白的陽性表達面積值在解毒通絡方各劑量組與ACEI組無明顯差異(P>0.05)，見表2。

表1 各組大鼠血清AngⅡ及心肌組織Hyp含量比較

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

表2 各組大鼠心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ陽性表達面積比較

與模型組比較:1)P<0.05；與對照組比較:2)P<0.05

2.4解毒通絡方對心肌TGF-β1蛋白表達的影響 模型組TGF-β1蛋白的陽性表達面積值〔(11.50±1.98)%〕明顯高于對照組〔(4.30±1.70)%,P<0.05〕，解毒通絡方低、中、高劑量組TGF-β1蛋白的陽性表達面積值〔(9.50±1.41)%,(7.60±1.41)%,(6.70±0.42)%〕明顯低于模型組(P<0.05)，而ACEI組〔(11.50±1.98)%〕高于解毒通絡方高劑量組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌 Col Ⅰ免疫組化結果(×200)

圖2 各組大鼠心肌 Col Ⅲ免疫組化結果(×200)

圖3 各組大鼠心肌 TGF-β1免疫組化結果(×200)

3 討 論

由于心肌損傷的致病原因很多，且臨床表現無特異性，故中醫臨床診療需要辨病與辨證相結合，因人、因時、因病情而遣方用藥，以發揮中醫藥特色。黃永生教授根據多年臨床實踐經驗提出以解毒通絡方治療心肌損傷，并且認為其病機關鍵為“毒傷血絡”。毒之產生為陰陽失衡，臟腑功能失調，氣血運行失暢，進而使體內的生理或病理產物不能及時排出，蘊結于體內對機體造成損傷。本著治病求本的原則，本方由夏枯草、牛膝、茺蔚子組成，其中夏枯草味苦辛、性寒，有疏通氣血的功效，其通絡散結之能恰以調暢營氣以散毒，是該方的君藥；牛膝味甘酸，性平，具有補益肝腎，滋陰潛陽之功，為臣藥；茺蔚子味辛甘、微苦、微寒，性涼，具順氣活血化瘀之功，祛瘀而通，上行而下達為佐使藥。三藥組合可使肝腎陰陽平衡，氣血暢通，營行毒除而通絡。通過多項實驗證實此三味藥在某種程度上有類似 ACEI的作用機制〔6〕。動物實驗及體外培養的成纖維細胞研究表明，經ACEI治療或處理后能減少膠原合成，從而預防和逆轉心肌纖維化〔7〕，其主要機制為降低循環和心臟局部Ang Ⅱ的濃度。這是ACEI發揮其抗纖維化作用的主要途徑，在此作為陽性對照探討解毒通絡方的作用機制。

有研究表明，RAAS在心肌纖維化過程中扮演了關鍵角色，該系統的激活可使循環和心肌局部的 Ang Ⅱ濃度增加，進而通過釋放、激活一系列細胞因子如TGF-β1，引起細胞外基質大量增生和過度積聚，導致心肌纖維化發生〔8〕。Hyp含量的高低在心肌纖維化的評估中有重要意義，可反映心肌膠原蛋白的含量，從而判斷心肌間質細胞增殖和纖維增生的程度。本研究表明，異丙腎上腺素激活RASS中Ang Ⅱ釋放，可誘導大鼠心肌膠原合成增加，加速心肌纖維化的進程。解毒通絡方可以通過抑制RAAS中Ang Ⅱ的釋放，進而減少心肌膠原蛋白的含量，進一步阻止心肌纖維化的發展進程。

心肌膠原有5種，以Ⅰ、Ⅲ型為主，Ⅰ型約占心肌膠原總數的80%，纖維粗，有較大的僵硬度和很強的抗牽拉特性，用于保持室壁的強度；Ⅲ型約占11%，纖維較細，伸展性和彈性較大，與室壁彈性有關。解毒通絡方可不同程度改善Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的沉積，從而干預心肌纖維化的形成。TGF-β1是一種多功能的蛋白肽，能增加以膠原為主的間質蛋白質的合成，為諸多因素導致心肌纖維化最后的共同中介之一。近年研究還發現，RAAS激活、Ang Ⅱ增高引起心肌損傷、心室重構均與 TGF-β1 增加有關，在心肌纖維化病程中，Ang Ⅱ可上調 TGF-β1受體表達，增強TGF-β1作用的敏感性，而TGF-β1則抑制細胞外基質降解、增加細胞外基質mRNA表達和蛋白質合成〔9，10〕。本研究可見，解毒通絡方可有效降低心肌組織中TGF-β1蛋白的表達，抑制細胞外基質合成、增加其降解。

綜上，解毒通絡方通過抑制被異丙腎上腺素激活的RASS中AngⅡ的釋放，而影響TGF-β1蛋白的合成，通過降低蛋白的合成和增加蛋白酶抑制物水平而阻滯基質降解，最終促進心肌纖維化發生及發展〔11，12〕，其作用機制與ACEI類藥物相似。

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〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R285.5

A

1005-9202(2017)19-4719-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.013

國家自然科學基金青年科學基金項目(81503544)

1 長春中醫藥大學附屬醫院心病科 2 吉林大學藥學院

郭家娟(1978-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事中醫心血管病證研究。

王景妍(1990-)，女，碩士，主要從事中醫心血管病證研究。