FABP3基因對心肌細胞凋亡的影響

楊 洋 徐 婭 劉楊安 鮑 媛 杜鴻麗 楊 名

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院網絡醫療部，湖北 武漢 430014)

FABP3基因對心肌細胞凋亡的影響

楊 洋 徐 婭 劉楊安 鮑 媛 杜鴻麗 楊 名

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院網絡醫療部，湖北 武漢 430014)

目的脂肪酸結合蛋白(FABP)3基因對心肌細胞凋亡的影響及機制。方法將H9C2心肌細胞分為空白對照組、陰性對照組、FABP3沉默組、FABP3沉默+空質粒組及FABP3沉默+過表達人FABP3組，轉染72 h后Western印跡檢測各組細胞中FABP3的蛋白表達；流式細胞儀檢測細胞凋亡；Western印跡檢測Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達。結果空白對照組與陰性對照組及FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組之間FABP3蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組FABP3的蛋白表達顯著低于空白對照組與陰性對照組，FABP3沉默+過表達人FABP3組FABP3的蛋白表達顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組(P<0.01)；FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組細胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表達顯著高于空白對照組與陰性對照組，Bcl-2蛋白表達顯著低于空白對照組與陰性對照組FABP3(P<0.01)；沉默+過表達人FABP3組細胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表達顯著低于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組，Bcl-2蛋白表達顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組(P<0.01)。結論沉默FABP3的表達可促進H9C2心肌細胞凋亡，過表達則抑制細胞凋亡，其機制與調節Cleaved caspase3及Bcl-2蛋白表達有關。

FABP3；心肌細胞；凋亡

心肌細胞凋亡可參與心力衰竭、冠心病、心肌炎、心絞痛及心臟自身免疫性疾病等多種心血管疾病的發生過程，但引起心肌細胞凋亡的機制研究的尚不清楚〔1〕。脂肪酸結合蛋白(FABP)3又稱為心臟型脂肪酸結合蛋白，為一種非分泌的可溶性蛋白，其可參與線粒體能量代謝，在心肌細胞能量產生過程中可將胞內長鏈脂肪酸轉運至線粒體，其過表達可顯著抑制心肌細胞增殖，誘導細胞凋亡〔2,3〕。文獻報道，FABP3可作為檢測早期心肌損傷的生物標志物〔4〕。但FABP3對心肌細胞凋亡的影響機制研究的尚不清楚。本研究通過沉默和過表達FABP3，檢測其對心肌細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 H9C2細胞株購自于中國科學院細胞庫；FABP3 siRNA及陰性慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司；目的質粒pCXN2-Flag-hFABP3及空質粒pCXN2--Flag由武漢大學動物實驗中心提供；FABP3、Cleaved caspase3、Bcl-2單克隆抗體及辣根過氧化物標記的二抗均購自美國abcam公司；CO2細胞培養箱購自德國Heraeus公司；BCA試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司；PAGE凝膠電泳儀、電泳凝膠圖像分析系統均購自美國Bio-Rad公司。

1.2H9C2心肌細胞培養、慢病毒及質粒轉染 H9C2心肌細胞在含有10%胎牛血清的培養基，置于37℃，5% CO2，95%飽和濕度的培養箱中培養。以1×105個/孔接種于6孔細胞培養板中，細胞生長密度達到60%以上時更換新的培養基。將細胞隨機分為空白對照組、陰性對照組及FABP3沉默組，各組細胞培養24 h后換為新鮮的培養基，在陰性對照組及FABP3沉默組中加入工作濃度為1.5 μg/ml的嘌呤霉素，空白對照組不加嘌呤霉素，篩選被慢病毒感染的細胞，各組細胞再繼續培養48 h后用熒光顯微鏡觀察細胞的感染效率。重新消化各組細胞，使每組的濃度為5×105個，接種于培養皿中，次日隨機選擇2皿FABP3組沉默的細胞，分別轉染空質粒和過表達人的FABP3質粒，培養6 h后更換培養液，此時細胞被分為空白對照組、陰性對照組、FABP3沉默組、FABP3沉默+空質粒組及FABP3沉默+過表達人FABP3質檢組，各組細胞再繼續培養72 h，收集細胞，用于后續實驗。

1.3各組細胞中FABP3的蛋白表達檢測 取收集的各組細胞，根據細胞蛋白提取試劑盒提取各組中的總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法對總蛋白進行定量，取50 μg蛋白樣品，按照1∶1的比例與上樣緩沖液混勻，置于100℃的孵育器中變性5 min，后續依次進行點樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、PVDF轉膜、脫脂奶粉封閉、一抗孵育(FABP3、GAPDH，1∶1 000稀釋)、洗膜、二抗孵育(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋)、TBST洗膜，ECL發光劑顯影，自動凝膠成像系統采集圖像。以GAPDH作為內參，分析FABP3的蛋白表達水平。

1.4細胞凋亡檢測 采用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡。以1×105個/孔將各組細胞接種于6孔細胞培養板中，轉染72 h后收集細胞，PBS洗滌細胞3次，500 μl結合緩沖液懸浮細胞，取懸浮細胞再加入5 μl的Annexin-V和PI，充分混勻后置于室溫環境下避光反應15 min，再加入400 μl結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達檢測 以5×105個/孔將各組細胞接種于10 cm的細胞培養皿中，72 h后收集細胞，按照1.3方法提取細胞蛋白并檢測蛋白含量，以GAPDH作為內參，分析Cleaved caspase3、Bcl-2的蛋白表達水平。

1.6統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1FABP3在轉染后細胞中的表達 空白對照組與陰性對照組及FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組FABP3蛋白表達差異不具有統計學意義(P>0.05)，FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組顯著低于空白對照組與陰性對照組，FABP3沉默+過表達人FABP3組顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組(P<0.01)。見圖1。

2.2FABP3對細胞凋亡率的影響 FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組細胞凋亡率顯著高于空白對照組與陰性對照組，FABP3沉默+過表達人FABP3組細胞凋亡率顯著低于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組(P<0.01)。見圖2。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3： FABP3沉默組；4：FABP3沉默+空質粒組；5：FABP3沉默+過表達人FABP3組；與空白對照組比較：1)P<0.01；與FABP3沉默+過表達人FABP3組比較：2)P<0.01；下圖同圖1 FABP3在轉染后細胞中的表達

圖2 FABP3對細胞凋亡率的影響

2.3FABP3對Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達的影響 FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組Cleaved caspase3蛋白表達顯著高于空白對照組與陰性對照組，FABP3沉默+過表達人FABP3組Cleaved caspase3蛋白表達顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組(P<0.01)；FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組Bcl-2蛋白表達顯著低于空白對照組與陰性對照組，FABP3沉默+過表達人FABP3組Bcl-2蛋白表達顯著高于FABP3沉默組和FABP3沉默+空質粒組(P<0.01)。見圖3。

圖3 FABP3對Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表達的影響

3 討 論

心血管疾病是危害人類健康、影響中老年人生活質量的主要疾病，其主要機制是心肌缺血缺氧導致心肌細胞凋亡，最后引起心力衰竭。心肌細胞凋亡是機體在一系列的程序控制作用下的一種病理過程，研究引起心肌細胞凋亡的基因及影響其凋亡的信號通路對于阻斷凋亡發生、維持或改善心功能、防止心肌細胞數目減少具有重要意義〔5〕。FABP3位于人染色體1p33-p32，編碼133個氨基酸，主要在細胞質中表達，參與轉運代謝及脂肪酸吸收，同時通過一系列過程為心肌提供能量〔6〕。研究顯示，過表達FABP3后能使心肌細胞的分化受到抑制，沉默FABP3的表達可促進細胞的凋亡，胞內ATP生成減少，心肌細胞的線粒體形態異常〔7〕。本研究也通過表達FABP3和沉默FABP3的方法，研究對心肌細胞凋亡的影響，結果與前人的研究一致。

細胞凋亡是機體在基因控制下的一種程序性死亡過程，其過程需要一系列酶的參與，目前caspase家族及Bcl-2家族是研究最多的兩大家族〔8〕。Caspase3是caspase家族的關鍵蛋白，是細胞凋亡過程主要的終末剪切酶，一般情況下Caspase3在胞質中以無活性的酶原形式存在，受到凋亡信號刺激后被激活，從而引起細胞凋亡〔9,10〕。有研究顯示，Caspase3的激活可引起細胞的凋亡〔11〕。Bcl-2是Bcl-2家族重要的一員，定位于18q21.3染色體，是Bcl-2家族的抑制凋亡基因，許多細胞凋亡過程中均可引起Bcl-2表達的下調，而Bcl-2的過表達可通過抑制多種因素降低細胞的凋亡〔12〕。有研究顯示心肌細胞凋亡過程中Bcl-2的表達下調〔13〕。本研究結果提示，沉默FABP3的表達可促進H9C2心肌細胞凋亡，過表達則抑制細胞凋亡，其機制與調節Cleaved caspase3及Bcl-2蛋白表達有關。該研究為心血管疾病的診斷及治療提供了理論基礎。

1Dalal S,Zha Q,Singh M,etal.Osteopontin-stimulated apoptosis in cardiac myocytes involves oxidative stress and mitochondrial death pathway:role of a pro-apoptotic protein BIK〔J〕.Mol Cell Biochem,2016;418(1-2):1-11.

2Dubey PK,Goyal S,Mishra SK,etal.Identification of polymorphism in fatty acid binding protein 3 (FABP3) gene and its association with milk fat traits in riverine buffalo (Bubalus bubalis)〔J〕.Trop Animal Health Prod,2016;48(4):849-53.

3Hasanally D,Edel A,Chaudhary R,etal.Psoriasis is associated with metabolic syndrome and cardiovascular disease.Fatty acid-binding proteins (FABP) have been recognized as predictors of these systemic disorders.The aim of this study was to assess correlations between levels of serum heart and adipocyte fatty acid-binding proteins (FABP3,FABP4) and disease severity,indicators of inflammation or metabolic disturbances,and topical treatment〔J〕.Lipids,2017;52(1):51-60.

4Yao DW,Luo J,He QY,etal.Thyroid hormone responsive (THRSP) promotes the synthesis of medium-chain fatty acids in goat mammary epithelial cells〔J〕.J Dairy Sci,2016;99(4):3124-33.

5Corbalan JJ,Vatner DE,Vatner SF.Myocardial apoptosis in heart disease:does the emperor have clothes〔J〕?Basic Res Cardiol,2016;111(3):1-13.

6Tang Z,Shen Q,Xie H,etal.Elevated expression of FABP3 and FABP4 cooperatively correlates with poor prognosis in non-small cell lung cancer(NSCLC)〔J〕.Oncotarget,2016;7(29):46253.

7Li A,Wu L,Wang X,etal.Tissue expression analysis,cloning and characterization of the 5′-regulatory region of the bovine FABP3 gene〔J〕.Mol Biol Rep,2016;43(9):991-8.

8Hu J,Xu M,Dai Y,etal.Exploration of Bcl-2 family and caspases-dependent apoptotic signaling pathway in Zearalenone-treated mouse endometrial stromal cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016;476(4):553-9.

9王燈亮,余良宏,林章雅,等.辛伐他汀體外對人 U251 腦膠質瘤細胞增殖及凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(12):2837-40.

10Liu C,Vojnovic D,Kochevar IE,etal.UV-A irradiation activates Nrf2-regulated antioxidant defense and induces p53/Caspase3-dependent apoptosis in corneal endothelial cells UV-A activates Nrf2 and induces p53 in corneal endothelial cells〔J〕.Invest Ophthal Vis Sci,2016;57(4):2319-27.

11Hu H,Liu Y,Kong B,etal.Protective effect of momordica charantia fruit extract on TNFα-induced NF-κB activation and cardiomyocyte apoptosis〔J〕.Int J Clin Exp Med,2016;9(3):5951-9.

12Delbridge ARD,Grabow S,Strasser A,etal.Thirty years of BCL-2:translating cell death discoveries into novel cancer therapies〔J〕.Nature Rev Cancer,2016;16(2):99-109.

13Zhang N,Ye F,Zhu W,etal.Cardiac ankyrin repeat protein attenuates cardiomyocyte apoptosis by upregulation of Bcl-2 expression〔J〕.Mol Cell Res,2016;1863(12):3040-9.

〔2017-06-07修回〕

(編輯 郭 菁)

R541.1

A

1005-9202(2017)19-4734-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.019

武漢市臨床醫學科研項目(WZ15D17)

楊 名(1971-)，男，碩士，主治醫師， 主要從事腫瘤內科研究。

楊 洋(1982-)，男，碩士，主治醫師， 主要從事腫瘤內科研究。