糖尿病腦病大鼠腦PET/CT顯像、胰島素樣生長因子受體及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達

張 鐸 孟 姮

(北華大學附屬醫(yī)院放射科，吉林 吉林 132011)

糖尿病腦病大鼠腦PET/CT顯像、胰島素樣生長因子受體及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達

張 鐸 孟 姮

(北華大學附屬醫(yī)院放射科，吉林 吉林 132011)

目的觀察糖尿病腦病大鼠腦PET/CT顯像、胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)4的表達。方法采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導大鼠糖尿病模型，Morris 水迷宮試驗篩選糖尿病腦病大鼠模型，正常對照組，糖尿病組(排除腦病)，糖尿病腦病組各隨機選取8只，進行腦部PET/CT顯像、免疫組化法檢測腦組織IGF-1R及GLUT4表達。結(jié)果與正常對照組及糖尿病組比較，糖尿病腦病組大鼠標準攝取值(SUV)顯著降低(P<0.01)；IGF-1R表達顯著增高而GLUT4顯著下降(P<0.01)。結(jié)論糖尿病腦病大鼠腦組織IGF-1R異常高表達，擾亂了腦部糖代謝的相關(guān)通路。

糖尿病腦??；PET/CT；胰島素樣生長因子1型受體；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4

PET/CT是根據(jù)示蹤原理，利用正電子放射核素標記的示蹤劑來探測正常和異常組織生理和生化改變。PET/CT在癲癇、老年性癡呆、帕金森病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、治療決策和療效評價等方面有重要意義。本研究利用PET/CT檢測糖尿病腦病大鼠模型腦部的糖代謝水平，并利用免疫組化方法檢測糖尿病腦病大鼠海馬區(qū)胰島素樣生長因子1型受體(IGF-1R)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)4的表達。

1 材料與方法

1.1一般資料 清潔級健康雄性Wistar大鼠，12周齡，體重200～250 g，購自吉林大學實驗動物中心。購回后飼養(yǎng)條件：室溫22℃～28℃，相對濕度40%～70%，每日12 h光照維持，晝夜循環(huán)，飼以蛋白質(zhì)含量為21%的標準飼料塊，自由飲水，分籠飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)1 w確認健康無病后用于實驗。

1.2主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma 公司)，18F-FDG注射液(吉林省硅谷醫(yī)院配制)，IGF-1R單克隆抗體、GLUT4單克隆抗體(英國Abcam公司),SABC免疫組化染色試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),檸檬酸，檸檬酸鈉(天津化學試劑廠),PET/CT掃描儀(美國GE公司),LifeScan 血糖儀(美國強生),Morris水迷宮自動監(jiān)控儀(中國科學院技術(shù)研究所)。

1.3糖尿病大鼠模型的建立 50只Wistar雄性大鼠，隨機挑選10只為正常對照組，剩余40只為模型組，適應性喂養(yǎng)1 w，禁食12 h，將 STZ 溶于檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mmol/L，pH=4.6)制成 0.5%的溶液，按 65 mg/kg體重腹腔單次注射。3 d后尾靜脈采血，檢測大鼠空腹血糖(FPG)值，>16.7 mmol/L 視為糖尿病模型建立成功。共成模36只，未成模者剔除。糖尿病模型成模12 w后，采用Morris水迷宮實驗檢測糖尿病腦病模型是否建立成功。實驗期間大鼠均喂標準飲食，自由覓水，此期間模型組死亡4只，考慮為血糖過高導致死亡。

1.4Morris水迷宮試驗篩選糖尿病腦病大鼠模型 成模后12 w后，PET/CT掃描前5 d開始試驗，前4 d為訓練，每天上、下午各4次，每只大鼠每次訓練2 min，將大鼠面向池壁隨機從4個入水點放入水中，記錄從入水到找到站臺所用的時間作為測試成績(逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺，逃避潛伏期計為2 min，并由實驗者將其牽引至平臺上，停留30 s后，放回籠中休息30 min之后，開始下一次測試。第5天為測試期，記錄逃避潛伏期。逃避潛伏期同正常對照組比較無統(tǒng)計學差異者，視為糖尿病組(排除腦病)，成模21只；同正常對照組比較，逃避潛伏期明顯延長，且出現(xiàn)認知功能減退的視為糖尿病腦病者，成模11只。正常對照組，糖尿病組，糖尿病腦病組各從中隨機選取8只，進行PET/CT的顯像及免疫組化研究。

1.5糖尿病腦病大鼠PET/CT顯像 根據(jù)大鼠體重注射造影劑18F-FDG 0.75 mCi/kg，注射30 min 后進行PET/CT顯像。顯像前采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，10 min以后，達到麻醉效果，昏睡狀態(tài)，對手術(shù)刺激無明顯反應，麻醉后仰臥固定。先采集CT定位像，電壓80 kV，電流30 mA，球管旋轉(zhuǎn)時間0.8 s，掃描層厚5 mm，重建層厚4.25 mm。隨即采集PET圖像，采集視野間的重疊數(shù)1，采集時間106 min。PET圖像經(jīng)OSEM重建，Xeleris工作站分別獲得CT、PET及兩者融合圖像，檢測大鼠腦部糖代謝情況。PET圖像均經(jīng)衰減校正處理。利用Xeleris圖像融合工作站調(diào)用PET/CT斷層圖像，獲得橫斷面數(shù)據(jù)，利用CT圖像準確選取最大切面，在PET圖像上，應用18F-FDG PET 檢測大鼠腦部葡萄糖代謝情況，利用感興趣區(qū)技術(shù)測定標準攝取值(SUV)。

1.6腦組織的處理及準備 PET/CT顯像后，迅速剪開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室進入升主動脈，同時剪開右心房，冰生理鹽水洗凈組織表面血液，冰盤上迅速斷頭取腦。取一側(cè)腦組織 4%多聚甲醛固定過夜，進行免疫組化染色。

1.7免疫組化檢測 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP法)，按試劑盒說明書檢測IGF-IR及GLUT4的表達。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 實驗過程中，糖尿病組大鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿及體重下降，色暗黃，后期精神較差，行動遲緩的癥狀。糖尿病腦病組除出現(xiàn)上述糖尿病組情況外，精神狀態(tài)更差，行動更加遲緩。第13周時，同正常對照組比較，糖尿病組和糖尿病腦病組體重明顯降低(P<0.01)，血糖值均明顯升高(P<0.01)，見表1。

2.2行為學測試結(jié)果 第1天各組大鼠逃避潛伏期無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，從第2～5天各組出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P<0.01或P<0.05)。同正常對照組相比，糖尿病組第4，5天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，糖尿病腦病組第2天開始逃避潛伏期就明顯延長(P<0.05,P<0.01)，與糖尿病組比較；糖尿病腦病組第4、5天逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)。見表2。

2.3糖尿病腦病大鼠PET/CT顯像 與正常對照組SUA(3.62±0.30)相比，糖尿病組大鼠SUV值降低趨勢極為顯著(2.11±0.25，P<0.01)；而糖尿病腦病組大鼠SUV具有同樣趨勢且更為顯著(0.31±0.03，P<0.01)；糖尿病組與糖尿病腦病模型組比較SUV值也有顯著差異(P<0.01)；說明與正常對照組比較，糖尿病大鼠葡萄糖代謝率明顯下降，而糖尿病腦病大鼠葡萄糖代謝率下降更為明顯。見圖1。

表1 各組大鼠血糖、體重比較

與正常對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與糖尿病組比較：3)P<0.05,4)P<0.01；下表同

表2 各組大鼠在 Morris 水迷宮中到達平臺的平均潛伏期比較

圖1 各組大鼠PET/CT腦部糖代謝檢測

2.4免疫組化檢測 同正常對照組相比，糖尿病腦病組IGF-1R含量明顯增多，而糖尿病組IGF-1R含量少于正常對照組。見圖2。同正常對照組相比，糖尿病腦病組GLUT4含量明顯減少，而糖尿病組GLUT4含量明顯增多。見圖3。

圖2 各組大鼠腦組織IGF-1R的表達(DAB，×40)

圖3 各組GLUT4的表達(DAB，×40)

3 討 論

由于Wistar大鼠具有多樣的行為表現(xiàn)，靈敏的情緒反應，適應能力強，探索性強，神經(jīng)系統(tǒng)反應方面與人有相似性等特點，故被廣泛應用于學習和記憶能力等行為學測試研究〔1，2〕。對于STZ的劑量，50～70 mg/kg體重均有使用，國內(nèi)外報道并不一致〔3～5〕。本實驗選用65 mg/kg，成模率較高。

PET/CT是目前臨床應用最廣泛的分子影像學檢測方法之一，不僅可以清晰地顯示出軀體或器官的解剖結(jié)構(gòu)，而且還可以精細地描繪出機體分子水平上的生理病理和生物代謝過程〔6〕。PET/CT 目前在臨床上主要應用在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和心血管系統(tǒng)疾病等〔7〕。PET/CT具有極高的敏感度，在糖尿病腦病出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變之前，即可發(fā)現(xiàn)其功能性改變，確定局部腦葡萄糖代謝率及腦功能狀態(tài)異常，對于早期發(fā)現(xiàn)和診斷糖尿病腦病具有較大的價值。

胰島素受體(IR)位于細胞膜上，為四聚體結(jié)構(gòu)，包括兩條α鏈、兩條β鏈及中間的二硫鍵。靶細胞膜上IR的α亞基與胰島素相結(jié)合，引起IR的構(gòu)象改變，α亞基對β亞基抑制去除，使β亞基上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化反應，導致下游的信號蛋白被依次激活，從而促使GLUT4移位，介導葡萄糖由外向內(nèi)轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)能量代謝。IR在腦內(nèi)的分布非常廣泛，海馬、嗅球、下丘腦等與學習、記憶和認知功能相關(guān)的大腦區(qū)域表達豐富〔8〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)胰島素/胰島素受體信號系統(tǒng)的正常運行是維持大腦血液運行和能量代謝正常進行的關(guān)鍵因素〔9〕，如該系統(tǒng)發(fā)生障礙，則易出現(xiàn)認知功能障礙及一系列病理生理改變。

研究表明，GLUT4在腦內(nèi)亦是選擇性表達的，例如在大鼠海馬、感覺運動區(qū)皮層、垂體后葉和下丘腦中均可見表達，尤其在海馬組織中表達量豐富〔10～12〕，其在腦內(nèi)的選擇性表達可能與胰島素刺激這些腦區(qū)對葡萄糖的攝取有關(guān)。葡萄糖是哺乳類動物大腦能量代謝的主要原料〔13〕，因其親水的特性，它不能通過脂質(zhì)雙層，但葡萄糖通過細胞膜是細胞產(chǎn)生能量的前提基礎(chǔ)，這一過程主要是通過GLUT4介導完成的〔14〕。GLUT4在腦組織能量代謝過程中的作用則顯得更為重要，其表達水平能反映腦組織細胞對葡萄糖的需求程度〔15〕。本實驗結(jié)果顯示，IGF-1R與GLUT4在糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展過程中起著更為重要的作用。

1Duarte JM,Nogueira C,Mackie K,etal.Increase of cannabinoid CB1 receptor density in the hippocampus of streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Exp Neurol,2007;204(1):479-82.

2Lin YH,Westenbroek C,Tie L,etal.Effects of glucose,insulin,and supernatant from pancreatic beta-cells on brain-pancreas relative protein in rat hippocampus〔J〕.Neurochem Res,2006;31(12):1417-24.

3Chang HK,Mukes JD,Figgers CL.Ameliorative effects of dietary caloric restriction on oxidative stress and inflammation in the brain of streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Am J Chin Med,2004;32(4):497-507.

4Ugochukwu NH,Bady NE.The effect of Gongronema latifolium extracts on serum lipid profile and oxidative stress in hepatocytes of diabetic rats〔J〕.J Biol Sci,2006;370(12):165-73.

5Elangovan V,Kohen R,Shohami E.Neurological recovery from closed head injury is impaired in diabetic rats〔J〕.J Neurotranma,2000;17(11):1013-27.

6Dunphy MP,Lewis JS.Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET〔J〕.J Nucl Med,2009;106S-121S.

7Vallabhajosula S.Molecular imaging:radiopharmaceuticals for PET and SPECT〔M〕.Berlin:Heidelberg,2009:201-8.

8Thomas T,Thomas G,Mclendon C,etal.β-amyloid-mediated vasoactivity and vascular endothelial damage〔J〕.Nature,1996;380:168-71.

9Dong XC,Park S,Lin XY.Irs1 and Irs2 signaling is essential for hepatic glucose homeostasis and systemic growth〔J〕.J Clin Invest,2006;1:32-6.

10Kobayashi M,Nikami H,Morimatsu M,etal.Expression and localization of insulin regulatable glucose transporter(Glut4)in rat brain〔J〕.Neurosci Lett,1966;213:103-6.

11Messari SE,Leloup C,Quignon M,etal.Immunocytochemical localization of the insulin regulatable glucose transporter(Glut4)in the central nervous system〔J〕.J Comp Neurol,1998;399:492-512.

12Vannucci SJ,Koehler-Stec EM,Li K,etal.Glut4 glucose transpoter expression in rodent brain effects of diabetes〔J〕.Brain Res,1998;797:1-11.

13Pardride WM.Brain metabolism:a perspective from the blood-brain barrier〔J〕.Physiol Rev,1983;63:1481-535.

14Mcewen BS,Reagen LP.Glucose transporter expression in the central nervous system:relationship to synaptic function〔J〕.Eur J Pharmacol,2004;490:13-24.

15Steen E,Terry BM,Rivera EJ,etal.Impaired insulin and insulin-like growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer’s disease is this type diabetes〔J〕.J Alzheimer Dis,2005;7:63-80.

〔2016-02-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R589

A

1005-9202(2017)19-4747-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.024

教育部博士基金項目(No.200801830071)

孟 姮(1968-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事神經(jīng)影像學研究。

張 鐸(1970-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事神經(jīng)影像學研究。