姜黃素對腦缺血大鼠腦組織PI3K/AKT信號通路的影響

仇志富 吳曉光 顏 勇 李蒙蒙 張麗華

(承德醫學院基礎醫學研究所，河北 承德 067000)

姜黃素對腦缺血大鼠腦組織PI3K/AKT信號通路的影響

仇志富 吳曉光 顏 勇 李蒙蒙 張麗華1

(承德醫學院基礎醫學研究所，河北 承德 067000)

目的探究姜黃素對腦缺血大鼠腦組織PI3K/Akt信號轉導通路的影響及機制。方法SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、低劑量姜黃素組、高劑量姜黃素組，每組大鼠18 只。其中模型組、低、高劑量姜黃素慢性腦缺血大鼠模型的制備采用將大鼠兩側頸動脈結扎的方法進行，假手術組和模型組分別灌胃給予生理鹽水。免疫組化法檢測PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白的表達，干濕重法檢測腦組織水含量，甲酰胺法檢測血腦屏障通透性。結果同模型組比較，姜黃素組PI3K、AKT、Bcl-2蛋白表達均明顯增高(P<0.05)，腦組織含水量、Bax蛋白表達及伊文思藍含量顯著降低(P<0.05)，高劑量姜黃素組效果優于低劑量姜黃素組。結論姜黃素對缺血性腦損傷的保護作用可能是其在降低血腦屏障通透性之后，激活了PI3K/AKT信號轉導通路，介導Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達降低，通過調節二者比值實現，姜黃素的腦保護效果與劑量相關。

姜黃素；PI3K/AKT信號通路；Bcl-2；Bax

腦缺血再灌注損傷中最常出現的是細胞凋亡。在眾多細胞凋亡機制涉及的信號轉導通路中，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號轉導通路是最為重要的，其發揮抑制細胞凋亡作用的機制可通過調控凋亡蛋白和基因的表達來實現〔1〕。神經營養因子能夠激活PI3K/AKT信號轉導通路，但是它作為大分子，通過血腦屏障很難。姜黃素是一種脂溶性酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗細胞凋亡等藥理作用，可以阻止神經元損傷，對神經變性病變具有保護作用；可以改善外周神經病、腦損傷等多種疾病癥狀〔2〕。但姜黃素對PI3K/AKT信號通路的影響卻鮮有報道。本研究觀察姜黃素對腦缺血模型大鼠腦組織中的PI3K、AKT、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)等凋亡密切相關蛋白的表達變化，大鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 成年雄性清潔級SD大鼠72只，體質量(250±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。姜黃素，購自上海鼎瑞貿易有限公司。PI3K、AKT兔抗大鼠多克隆免疫組化試劑盒，購自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗人Bcl-2、Bax多抗，購自上海延生實業有限公司；其他試劑皆為國產分析純。

1.2動物分組和處理 大鼠稱重編號后用隨機數字表法分組：假手術組、模型組、低、劑量姜黃素組、高劑量姜黃素組，各18只。35 mg/kg水合氯醛麻醉后，參照文獻〔3〕方法造模，模型組、低、高劑量姜黃素組、腦缺血大鼠模型的制備采用將大鼠兩側頸動脈結扎的方法進行，假手術組僅僅裸露頸總動脈、神經。用二甲基亞砜(DMSO)將姜黃素純品配制成終濃度為50 mg/L的母液，過濾除菌后于-20℃避光存儲，每次用前將培養液稀釋至所需濃度。在造模后第28天起，低、高劑量姜黃素組予200、300 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，連續干預35 d；假手術組及模型組給予生理鹽水。

1.3PI3K、AKT蛋白表達檢測 在最后給藥的12 h之后，按隨機方法在每組中選出6只大鼠，以乙醚麻醉斷頭處理，選取視交叉至漏斗部之間的腦組織，10%CH3CHO置于4℃冰箱固定48 h，石蠟包埋，冠狀切片5 μm厚，常規脫蠟、酒精浸水，以檸檬酸鹽緩沖液微波法進行抗原修復，水洗后分別滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT(1∶100)多抗，于4℃下靜置12 h，孵育液30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色之后蘇木精復染，常規脫水、透明、封片。陽性細胞吸光度的檢測：MiVnt圖形采集分析系統、取平均值、利用PBS作陰性對照。

1.4凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax的檢測 按照SABC步驟染片，將48 h的腦組織切片脫蠟至水，嚴格按照試劑盒說明書操作進行，高倍鏡下觀察胞質著色呈棕黃色的為陽性細胞。

1.5腦組織含水量檢測 各組隨機取6只大鼠斷頭、取腦，去除嗅球部分，稱濕重后于90℃干燥箱干燥24 h，再稱重，計算腦組織含水量。

1.6血腦屏障通透性檢測 每組遺留的6只大鼠，2%伊文思藍于大鼠的尾部靜脈注射，3 h后以水合氯醛麻醉，0.2 L生理鹽水于大鼠左心室注射來沖洗血管內血液，取腦稱量，腦組織放于甲酰胺內，于60℃下水浴24 h，勻漿后離心(1 000 r/min，6 min)，635 nm波長處檢測上清液的OD值，以此計算伊文思藍含量。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行LSD檢驗，Games-Howell檢驗。

2 結 果

2.1各組PI3K蛋白、AKT蛋白陽性表達比較 PI3K蛋白、AKT蛋白陽性表達為棕黃色模型組較假手術組PI3K、AKT明顯升高(P<0.05) ；與模型組比較，低、高劑量姜黃素組PI3K、AKT蛋白均明顯增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組PI3K、AKT蛋白陽性表達、含水量及伊文思藍含量、Bcl-2、Bax蛋白表達比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.2各組腦組織含水量比較 模型組較假手術組腦組織水含量明顯增加(19.93±4.69)%(P<0.05)；低、高劑量姜黃素組較模型組腦組織水含量分別下降了(13.99±1.98)%和(12.99±1.97)%(P<0.05)，見表1。

2.3各組血腦屏障通透性比較 模型組較假手術組伊文思藍顯著增加(596.39±129.79)%(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量姜黃素組伊文思藍各自降低了(42.97±7.92)%和(39.85±7.93)%(P<0.05)，見表1。

2.4Bcl-2、Bax蛋白表達變化 在梗死灶周圍皮質或紋狀體內可見Bcl-2陽性細胞，假手術組只可呈現Bcl-2、Bax少量反應。缺血周邊區，模型組及姜黃素組Bcl-2、Bax蛋白表達皆較假手術組升高(P<0.05)。姜黃素組Bcl-2表達明顯高于模型組(P<0.05)，Bax表達明顯少于模型組(P<0.05)，見表1。

3 討 論

有效地抑制或減少細胞凋亡是實現腦保護作用的重要手段。PI3K/AKT信號轉導通路作為細胞生存的信號通路之一，其在細胞增殖、分化、抑制神經細胞凋亡方面起重要作用〔4〕。腦缺血后，機體本身可以釋放出一些能夠將具有酪氨酸激酶活性受體激活的物質，如神經細胞生長因子、整合素等，受體經過其磷酸化以后會特異性地結合PI3K的調節亞基，從而將PI3K激活；同時兼備脂類激酶活性與蛋白激酶活性的PI3K激活后可以使細胞膜上的肌醇發生磷酸化，生成第二信使。PI3K結合其下游的效應分子AKT的PH結構域，AKT從細胞質向細胞膜轉位，構象改變，Thr308位點及Ser473位點發生磷酸化，由抑制狀態變為激活狀態。AKT活性的最終實現需要依賴Ser473的磷酸化，AKT磷酸化激活后即成為p-AKT。p-AKT通過直接將其下游凋亡靶蛋白磷酸化或者間接改變、編碼凋亡相關蛋白的基因表達水平來實現腦保護作用〔5，6〕。總之，PI3K/AKT信號通路激活后，能夠作用于Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB等下游凋亡靶蛋白，通過激活或抑制表達來發揮生物學效應。本實驗與呂俊杰等〔7〕結論一致，提示缺血再灌注損傷中，姜黃素發揮的保護效果必然與PI3K/AKT信號通路的激活密不可分。

血腦屏障通透性破壞引發的腦水腫對于神經細胞損傷和凋亡發揮著促進作用，使細胞功能障礙和壞死現象加重，因此兩者經常被選為衡量缺血性腦病治療效果的指標〔8〕。Bcl-2/Bax值直接影響細胞凋亡狀態，Bcl-2/Bax值越大，則對凋亡抑制作用越明顯，反之，則促進凋亡。二者發揮作用的方式都是經過上游生物學信號激活之后，通過對相關下游基因的激活來完成的，其中PI3K/AKT信號通路便可激活二者，調節兩者之間的比值變化〔9，10〕。本實驗中姜黃素給藥后，兩者比值發生顯著變化，提示由PI3K/Akt信號通路激活所引發Bcl-2/Bax值變化。本文結果顯示姜黃素能夠降低BBB通透性，激活PI3K/AKT信號轉導通路，通過介導Bcl-2、Bax發生相應變化，即調節二者比值實現減輕腦水腫、抑制細胞凋亡的生物學效應。然而PI3K/AKT信號通路激活后可以介導多種凋亡因子，本文僅研究了凋亡因子Bcl-2、Bax，姜黃素激活PI3K/AKT信號通路后是否也能介導其他凋亡因子發生改變尚不明確；姜黃素的療效與其給藥劑量密切相關，何種劑量能夠發揮其最佳療效尚需研究；同時，信號轉導通路眾多，其是否能夠激活其他重要的通路仍然不得而知。

1謝 飛，魏 珂，閔 蘇，等.神經生長因子對H9c2心肌細胞缺氧/復氧后凋亡的保護作用及其機制〔J〕.中國藥理學通報，2014；4(17)：506-10.

2李 勇，王蓬文.姜黃素神經保護作用研究概況〔J〕.中國中藥雜志，2009；24(9)：3173-5.

3Chang L，Graham PH，Hao J，etal.Acquisition of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell phenotypes is associated with activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway in prostate cancer radioresistance〔J〕.Cell Death Dis，2013；4(7)：391-7.

4張藺珊，李娟娟，吳春云.腦缺血的損傷機制及相關信號通路的研究進展〔J〕.神經解剖學雜志，2014；6(25)：729-32.

5郁 迪，莫緒明.PI3K/Akt和MAPK信號通路在缺血性腦損傷中的保護作用〔J〕.醫學綜述，2015；2(19)：210-3.

6黃雄峰，汪建民.葛根素的神經保護作用機制研究進展〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2015；4(13)：224-30.

7呂俊杰，武雅琴，蔣 峰，等.姜黃素對大鼠肺缺血再灌注損傷肺泡Ⅱ型細胞的保護作用〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(5)：992-4.

8鄭立霞，徐鑫淼，郎現波，等.胍丁胺對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的作用機制研究〔J〕.中國臨床藥理學雜志，2015；7(14)：544-7.

9馬 娜，郭瑞珍，阮 媛，等.PI3K-AKT-Bcl-2抗凋亡途徑與瘢痕癌癌細胞凋亡相關性探討〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2014；8(16)：〗

10韓 軍，宣佳利，胡浩然，等.金絲桃苷預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用與PI3K/Akt信號通路的關系〔J〕.中國中藥雜志，2015；1(5)：118-23.

〔2016-06-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R285

A

1005-9202(2017)19-4756-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.028

1 華北石油總醫院普外科

吳曉光(1975-)，男，碩士，主要從事腦缺血損傷機制及藥物干預研究。

仇志富(1988-)，男，碩士在讀，主要從事腦病損傷機制及藥物干預研究。