過表達轉錄因子21對肺癌細胞裸鼠成瘤的影響

李志英 周 軍 閆廷贊 周 倜 葉 姍

(常州市第一人民醫院呼吸內科，江蘇 常州 213000)

過表達轉錄因子21對肺癌細胞裸鼠成瘤的影響

李志英 周 軍 閆廷贊 周 倜 葉 姍

(常州市第一人民醫院呼吸內科，江蘇 常州 213000)

目的探討轉錄因子(TCF)21對肺癌細胞裸鼠成瘤的影響。方法選取人肺癌細胞SPC-A1，細胞轉染TCF21過表達載體(過表達組)和空載體(空載體組)，設置對照組，對照組中只加入轉染試劑，培養48 h，Western印跡檢測細胞中TCF21的表達水平。將過表達TCF21的肺癌細胞接種到裸鼠皮下，分別在5、10、15、20 d測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。在20 d時，取出腫瘤，稱量腫瘤重量，并計算瘤重抑瘤率，同時Western印跡檢測腫瘤組織中B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、TCF21表達水平。結果過表達組肺癌細胞中TCF21水平明顯高于對照組(P<0.01)。過表達組腫瘤生長與對照組相比明顯受到抑制(P<0.01)。空載體組和過表達組的抑瘤率分別為(7.52±0.07)% 和(72.24±0.61)%，且過表達組腫瘤重量明顯低于對照組(P<0.01)。過表達組腫瘤組織中Cleaved Caspase-3、TCF21表達水平明顯高于對照組，而Bcl-2水平明顯低于對照組(均P<0.01)。結論TCF21能夠抑制肺癌細胞的裸鼠成瘤能力。

肺癌；裸鼠成瘤；轉錄因子21；腫瘤生長曲線

肺癌發病早期沒有明顯的癥狀，有超過60%的患者在就診時已處于晚期，另外肺癌具有易轉移、生長速度快、預后差等特點〔1〕。轉錄因子(TCF)21是一種抑癌基因，在乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌等組織中均發現TCF21表達下調甚至缺失〔2〕。TCF21能夠抑制結直腸癌細胞的生長并對結直腸癌裸鼠成瘤能力具有抑制作用〔3〕。本研究探討TCF21對肺癌細胞裸鼠成瘤能力的作用。

1 材料與方法

1.1材料 細胞：人肺癌細胞SPC-A1購于中國科學院細胞庫。3～5周齡,體重18～22 g的雄性Balb/c裸鼠21只由江蘇醫科大學動物實驗中心提供。主要儀器及試劑：胎牛血清購自美國Gibco；RPMI1640培養基、胰蛋白酶、硝酸纖維素膜均購自美國Sigma；Lipofectamine 2000轉染試劑購自上海翊圣生物科技有限公司；CO2培養箱購自上海精密儀器儀表有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3單克隆抗體、TCF21單克隆抗體、β 肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體均購自無錫安迪生物工程有限公司。

1.2細胞培養 取保存于液氮罐中的人肺癌細胞SPC-A1，放到37℃中融化1 min，觀察細胞完全融合后，轉移至離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用含有10% 胎牛血清的RPMI1640細胞培養液懸浮細胞，接種到細胞培養瓶中，放在37℃，5% CO2培養箱中培養48 h。觀察細胞密度達到85%時，倒掉細胞培養液，加入0.25%的胰蛋白酶，放在37℃消化2 min，加入細胞培養液，離心后，加入適量的細胞培養液懸浮細胞，接種到細胞培養瓶中繼續培養。

1.3細胞轉染 取培養至對數生長期的SPC-A1細胞，以每孔4×105個細胞接種到6孔細胞培養板中，觀察細胞融合度達到80%時，轉染開始。轉染前將細胞培養液更換為不含胎牛血清的不完全培養液。取244 μl的不含胎牛血清的不完全培養液與6 μl的 Lipofectamine 2000混合后放在室溫下靜置5 min記為A液；將246 μl的不含胎牛血清的不完全培養液與4 μl的pIRES2-ZsGreen-TCF21質粒載體(過表達組)、空載體質粒載體(空載體組)混合后記為B液。取A液與B液在室溫下混合靜置20 min，加入到6孔細胞培養板中，放在37℃，5% CO2培養箱中培養5 h，更換為含有胎牛血清的完全培養液繼續培養24 h，用G418法篩選能夠穩定表達質粒基因的細胞株進行后續實驗。同時設置對照組，對照組中只加入轉染試劑。

1.4Western印跡檢測細胞中TCF21水平 取轉染后的SPC-A1細胞，用細胞刮刀收集細胞，加入細胞裂解液，放在冰上裂解反應15 min后，4℃，15 000 r/min離心30 min。吸取上清液，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒對蛋白樣品定量后，與加樣緩沖液按照4∶1的比例混合均勻，放在100℃的沸水中煮沸5 min，每孔加入40 μl至蛋白凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，蛋白沒有進入分離膠之前用60 V電壓電泳，進入分離膠后用100 V電壓電泳。將蛋白凝膠在4℃，250 mA恒流下轉印90 min至硝酸纖維素膜上，放在5%脫脂奶粉中在37℃封閉60 min。依次放在一抗(600倍稀釋，4℃過夜)、二抗(37℃，90 min)結合后，加入化學增強發光法(ECL)顯色液，以β-actin為內參，用Quantity one分析目的蛋白相對表達量。

1.5裸鼠成瘤 21只雄性Balb/c裸鼠隨機分為三組，每組7只，取培養至對數生長期的對照組、空載體組、過表達組的細胞，配制成4×105個/ml濃度的細胞懸浮液，每組每只裸鼠取200 μl的細胞懸浮液接種到裸鼠的前肢背部的皮下。觀察腫瘤出現后，分別在5、10、15、20 d用游標卡尺測量長徑和短徑，計算裸鼠的腫瘤體積。腫瘤的體積=長徑×短徑2×0.5。在第20天時，處死各組裸鼠，分離腫瘤，稱量移植瘤的重量，并計算每組的瘤重抑瘤率。瘤重抑瘤率=100%×(1-轉染組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)。

1.6Western印跡檢測組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達水平 取各組腫瘤組織，提取組織蛋白，按照1.5中Western印跡檢測組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達水平。

1.7統計學方法 應用SPSS22.0軟件行t檢驗、單因素方差。

2 結 果

2.1轉染后細胞中TCF21表達水平檢測結果 細胞轉染后，培養48 h，過表達組細胞中TCF21表達水平(1.22±0.6)明顯高于對照組(0.56±0.05)(P<0.01)。空載體組(0.57±0.04)與對照組相比沒有明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測轉染后細胞中TCF21表達水平

2.2腫瘤生長曲線及抑瘤率 如圖2所示，第5天開始，對照組和空載體組腫瘤的生長明顯高于過表達組(P<0.01)。空載體組和過表達組的抑瘤率分別為(7.52±0.07)% 和(72.24±0.61)%；過表達組腫瘤的重量〔(165.43±14.54)mg〕明顯低于對照組〔(596.36±15.67)mg〕(P<0.01)，空載體組〔(551.61±16.98)mg〕與對照組無統計學差異(P>0.05)。

圖2 腫瘤生長曲線

2.3組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達水平檢測結果 過表達組中Cleaved Caspase-3、TCF21水平均明顯高于對照組，Bcl-2水平明顯低于對照組(均P<0.01)。空載體組和對照組中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達水平無統計學差異(P>0.05)。見表1，圖3。

圖3 Western印跡檢測腫瘤組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達水平

組別CleavedCaspase-3Bcl-2TCF21對照組0.64±0.040.62±0.060.46±0.06空載體組0.64±0.050.62±0.080.46±0.07過表達組1.05±0.081)0.11±0.031)0.78±0.131)

與對照組比較：1)P<0.01

3 討 論

肺癌的發病率在男性惡性腫瘤中位居首位，在女性惡性腫瘤中位居第3位〔4〕。目前治療肺癌的主要方法為手術治療、放化療輔助治療，但由于肺癌具有易轉移等特點，5年內的生存率只有20%左右〔5〕。

TCF21基因定位于6號染色體的6q32-24，TCF21是堿性螺旋-環-螺旋家族的成員之一，其在肺組織、腸道組織、腎組織、性腺等組織中均有表達〔6〕。研究表明，TCF21與腫瘤的發生有關，在乳腺癌、淋巴瘤、結直腸癌、卵巢癌等組織中均發現TCF21基因表達異常下調或缺失〔7〕。激活TCF21基因的表達后，腫瘤的生長受到抑制，在頭頸部癌癥、腎癌等癌癥中均得以證實〔8〕。有研究表明，促進肺癌細胞中TCF21表達后，肺癌細胞的生長受到抑制，凋亡增多〔9〕。本研究結果說明，TCF21能夠在體內抑制腫瘤的生長，能夠抑制肺癌細胞裸鼠成瘤。

Bcl-2是目前公認的與腫瘤細胞生長和凋亡有關的蛋白，能夠抑制腫瘤細胞的凋亡，是一種抑凋亡蛋白〔10〕。Caspase-3是Caspase蛋白家族成員之一，在Caspase級聯反應中發揮凋亡執行作用，Caspase-3活化后能夠促進凋亡的發生〔11〕。本研究結果提示，TCF21抑制肺癌細胞裸鼠成瘤可能與促進肺癌細胞凋亡有關。

1Brahmer J,Reckamp KL,Baas P,etal.Nivolumab versus docetaxel in advanced squamous-cell non-small-cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med,2015;373(2):123-35.

2Yang Z,Li DM,Xie Q,etal.Protein expression and promoter methylation of the candidate biomarker TCF21 in gastric cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2015;141(2):211-20.

3Dai Y,Duan H,Duan C,etal.Down-regulation of TCF21 by hypermethylation induces cell proliferation,migration and invasion in colorectal cancer〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016;469(3):430-6.

4楊大運,邢亞威,張月花,等.老年非小細胞肺癌中 Raf 激酶抑制蛋白與 p-AKT 的表達及意義〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(3):644-5.

5J?nne PA,Yang JC,Kim DW,etal.AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med,2015;372(18):1689-99.

6Kim JB,Pjanic M,Sazanova O,etal.TCF21 Regulates coronary artery disease causing aryl-hydrocarbon receptor gene expression and its downstream pathway activation by environmental ligands〔J〕.Circulation,2015;132(3):A17671.

7Arab K,Park YJ,Lindroth AM,etal.Long noncoding RNA TARID directs demethylation and activation of the tumor suppressor TCF21 via GADD45A〔J〕.Mol Cell,2014;55(4):604-14.

8Wang J,Gao X,Wang M,etal.Clinicopathological significance and biological role of TCF21 mRNA in breast cancer〔J〕.Tumor Biol,2015;36(11):8679-83.

9Yoo S,Leung SY,Zhu J.Abstract B22:Integrative analysis of DNA methylation and gene expression data reveals complex regulation of gastric cancer〔J〕.Cancer Res,2016;76(2 Supplement):B22.

10武 曉,劉鳳娟,王鵬飛,等.巴豆生物堿對肺腺癌細胞凋亡的影響及機制研究〔J〕.中國醫藥導報,2016;13(1):17-20.

11Dar AA,Pradhan TN,Kulkarni DP,etal.Extracellular 2′ 5′-oligoadenylate synthetase 2 mediates T-cell receptor CD3-ζ chain down-regulation via caspase-3 activation in oral cancer〔J〕.Immunology,2016;147(2):251-64.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R739.41

A

1005-9202(2017)19-4760-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.030

江蘇省前瞻性研究專項基金項目(No.BE2013629)

周 軍(1969-)，男，碩士，主任醫師，主要從事肺癌的臨床診療研究。

李志英(1979-)，女，碩士，主治醫師，主要從事肺癌的基礎與臨床研究。