Borna病病毒與病毒性腦炎及精神分裂癥的關系

張 麗 劉 玫 徐 平 蔣國紅

(遵義醫學院附屬醫院神經內科，貴州 遵義 563000)

Borna病病毒與病毒性腦炎及精神分裂癥的關系

張 麗 劉 玫 徐 平 蔣國紅

(遵義醫學院附屬醫院神經內科，貴州 遵義 563000)

目的探討Borna病病毒(BDV)與精神分裂癥(SCH)及病毒性腦炎(VE)發病的關系。方法對來自遵義市、畢節地區等貴州省部分地區的健康人100例、SCH患者30例、VE患者62例的外周血單核細胞(PBMC)采用巢式逆轉錄熒光定量PCR法檢測是否存在BDVp24基因片段，并純化、克隆陽性產物，對陽性產物測序并進行同源性分析。結果BDVp24基因片段在VE〔6.5%(4/62)〕與健康人(0%)中的陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)，但健康人與SCH患者陽性率〔6.7%(2/30)〕比較無顯著差異(P>0.05)。SCH患者與VE患者經檢測之后存在完全相同的測序結果，相較于GenBank提供的Strain V毒株、C6BV毒株、1766毒株和He80/FR病毒株存在3%、3%、2%和3%的突變率，其中有3個、3個、2個和3個位點發生一致的基因沉寂性突變，BDV與1766毒株最相似，SCH患者的臨床表現與VE患者的臨床表現相似。結論遵義市、畢節地區等貴州省部分地區VE的發生率可能與BDV感染有關。BDV p24基因片段未在健康人中檢出。

Borna病病毒；精神分裂癥；病毒性腦炎

Borna病病毒(BDV)是一種中樞神經系統的嗜神經病毒，BDV感染可引起腦脊髓炎，出現精神行為異常〔1〕。馬類最容易被感染，還可以感染鳥類及驢、騾、羊、牛和貓等動物，人類也有被感染的報道，雖然病例數相對較少，但仍需要醫護人員予以高度重視〔2〕。許多國外學者對BDV與病毒性腦炎(VE)及精神分裂癥(SCH)的關系進行了研究，但多集中于牲畜，關于人BDV感染的研究較少〔3〕。本文通過檢測SCH和VE患者及健康人的外周血單核細胞(PBMC)是否存在BDVp24基因片段，并純化、克隆陽性產物及對陽性產物測序和同源性分析，試圖探明其感染途徑，以期為疾病的早期診斷、治療及疫苗研制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1研究對象 選擇2010年1～7月經遵義醫學院附屬醫院收治的來自遵義市、畢節地區的VE患者62例，男35例，女27例，年齡14～76〔平均(32.84±10.23)〕歲；同期經遵義市優撫醫院收治的來自遵義市、畢節地區的SCH患者30例，男14例，女16例，年齡19～63〔平均(43.84±7.62)〕歲。納入標準：(1)VE患者經臨床癥狀、腦脊液生化和常規檢測、腦電圖檢查等方式明確診斷；(2)SCH患者按照中國精神障礙分類與診斷標準第3版(CCMD-Ⅲ)的診斷標準，患者臨床癥狀及表現符合SCH臨床診斷標準；(3)入選患者一般人口學資料完整，采集的標本滿足本研究中的所有檢測項目。排除標準：合并其他疾病(可能影響檢測結果，如細菌及真菌性腦炎、藥物或精神活性物質所致精神障礙)者。同期在遵義醫學院附屬醫院或遵義市優撫醫院進行體檢的健康人100例，男50例，女50例，年齡21～64〔平均(44.87±5.94)〕歲。VE、SCH患者及健康人的性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)、微量加樣器(德國Eppendorf公司)、逆轉錄儀(美國應用生物系統公司)。熒光探針、內、外引物在中山醫科大學達輝基因診斷中心合成。熒光探針：3′標記的是4-甲基羅達明(TAMRA)，5′標記的是62羧基熒光素(FAM)。

1.3方法 為了防止各種試劑及標本的污染，嚴格按消除RNase的常規方法對所有涉及RT2PCR實驗的用品進行處理。抽取每位研究對象外周血5 ml，常規處理后采用Ficoll-conray液分離出PBMC，采用Tripure RNA提取試劑盒(購于北京博凌科為生物科技有限公司)提取細胞總RNA，已經提取的RNA標本置-70℃冰箱保存。將RNA按照逆轉錄試劑盒(藍博生物技術有限公司提供)中提供的方法進行逆轉錄，將產物置-20℃冰箱保存。

1.4BDV質粒標準曲線制備方法 以陽性模板為陽性重組質粒，定量、稀釋之后形成102、103、104、105的濃度梯度，PCR擴增采用ABI Prism 7500 型擴增檢測儀，PCR產物定量實時監測設置為每間隔8 s進行一次，最終獲取PCR擴增動力學曲線。以首先獲得數據的自然對數作為橫坐標，以Ct值為縱坐標，獲得定量標準曲線，斜率、截距和相關系數依次為-3.389 078、45.098 53和0.996 475。

1.5巢氏逆轉錄熒光定量PCR 共分2輪，第一輪行常規PCR，第二輪行熒光定量PCR，在第二輪擴增的PCR反應混合物中加入熒光探針及第一輪產物。

1.6陽性BDV P24基因片段處理 首先采用醋酸鈉乙醇沉淀法對PCR產物進行純化，然后將純化后的產物與pMD1-T載體進行連接，再用大腸桿菌進行轉化，采用藍白斑法對重組子進行篩選，并收集每一標本的陽性菌落進行培養。采用FQ-PCR對提取后的質粒DNA進行鑒定，再對陽性質粒進行測序。

1.7統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1BDVp24 基因片段的檢測率 VE患者BDVp24基因片段陽性率〔6.5%(4/62)〕明顯高于健康人(0例，P<0.05)；SCH患者中雖也有陽性檢出者，但由于陽性率較低〔6.7%(2/30)〕，但與健康人比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2BDVp24 基因片段序列測定結果 與國外標準株和流行株(GenBank提供)進行同源性分析，分析時采用基于局部比對算法的搜索工具(BLSAT)軟件，分析結果顯示陽性產物均證明為BDVp24基因片段，SCH患者與VE患者的測序結果一致，相較于Strain V毒株(GenBank提供)存在3%的突變率，其中3個位點發生一致性沉寂突變(nt1674 C-T，nt1671C-T，nt1650 T-C)；相較于C6BV毒株存在3%的突變率，其中3個位點發生一致性沉寂突變(nt1671 C-T，nt1668 A-G，nt1659 T-C)；相較于1766毒株存在2%的突變率，其中的nt1678 T-C和nt1675 C-T 2個位點發生一致性沉寂突變；相較于He80/FR病毒株存在3%突變率，其中的nt1672 C-T，nt1669 A-G和nt1660 T-C 3個位點發生一致性沉寂突變。相比之下，此次檢測的BDV陽性BDVp24基因片段與1 766毒株最相似。見圖1，圖2。

6例呈S型曲線(陽性)，SCH為②③；VE為①④⑤⑥ 圖1 FQ-nRT-PCR檢測VE與SCH患者PMBCs中BDV RNA 的熒光Rn循環數變化曲線

Strain V(核苷酸序列號：AJ311521)，H1766(核苷酸序列號：AJ311523)，He80/FR(核苷酸序列號：AJ311522)圖2 VE及SCH患者BDV p24核苷酸序列結果及與馬BDV p24核苷酸序列(86bp)比較

2.3陽性患者臨床表現 BDVp24基因片段陽性的SCH患者與VE患者的臨床表現具有相似性，即均有精神行為的異常。SCH患者出現精神行為異常是毋庸置疑的；而4例VE患者臨床表現不同程度精神異常，有些煩躁不安、言語增多、胡言亂語，有些情感淡漠、不語、不動，有些有幻覺及被害妄想，有些甚至有沖動攻擊行為，只是SCH患者的精神癥狀更嚴重。

3 討 論

BDV屬于中樞神經系統新發病毒中的一種，動物和人感染該病毒后主要表現為精神行為異常，主要病理改變為邊緣系統中積聚特異性抗原及炎性細胞浸潤腦膜及腦細胞〔4〕。德國的Rott于1985年通過熒光抗體法在SCH癥患者身上檢測出腦脊液BDV抗體〔2〕，進而人們認識到BDV可能感染人類。臨床研究中不少VE患者出現精神行為異常，但他們的病因一直未能明確，后來發現BDV感染的馬與這些精神行為異常的腦炎患者臨床表現極為相似，于是猜想BDV感染與不明原因的VE有關？較城市居民而言，農村居民中VE患者的發病率較高，其原因是農村居民與動物接觸機會較多，所以猜想人類感染BDV較理想的模型是VE〔5〕。有研究〔6〕指出我國約2%～13%的神經精神疾病患者有BDV感染，而不同地區BDV感染率呈現出較大的差異。

本研究中，VE患者BDVp24基因片段陽性率高于健康人，原因可能為〔7～11〕：(1)收集的標本并不是在VE疾病高峰時的標本，即不同檢測時間呈現出不同的檢出率；不同的標本類型有不同的檢出率，腦脊液通常比外周血陽性率高一點，而本次的標本是外周血。(2)檢測差異可能也與檢測方法有關。(3)不同區域存在不同生活習慣與生活方式，與動物接觸的概率存在差異，其感染BDV的可能性也不同。(4)在實際操作中分離PBMC技術水平低、標本保存不合理、操作細節處理不細致等個人原因促使RNA降解，進而對檢測BDVp24基因片段造成影響〔12〕。

1Cloes R，Ahmad A，Reintjes R.Risk communication during the 2009 influenza A(H1N1)pandemic：stakeholder experiences from eight European countries〔J〕.Disaster Med Public Health Prep，2015；9(2)：127-33.

2陳 靜，徐 平.博爾納病病毒的生活周期〔J〕.貴州醫藥，2015；39(7)：658-60.

3Scordel C，Huttin A，Cochet-Bernoin M，etal.Borna disease virus phosphoprotein impairs the developmental program controlling neurogenesis and reduces human GABAergic neurogenesis〔J〕.PLoS Pathog，2015；11(4)：e1004859.

4姚能云，佘艷梅，周紅勤，等.以精神行為異常起病的腦炎患者與博爾納病病毒感染的關系〔J〕.中華神經科雜志，2015；48(4)：307-11.

5葉緒芳，趙蘇曄.貴州省農村地區病毒性腦炎感染現狀研究〔J〕.中國衛生標準管理，2016；7(17)：9-11.

6陳 靜，徐 平，劉海軍.病毒性腦炎患者腦脊液博爾納病病毒p40基因片段的檢測〔J〕.中國實用神經疾病雜志，2016；19(3)：1-3.

7Honda T.Neuropathogenesis of persistent infection with Borna disease virus〔J〕.Uirusu，2015；65(1)：145-54.

8劉海軍，謝祖勤，郭 霞，等.貴州部分地區精神分裂癥患者血清PBMC博爾納病病毒CIC及抗體的檢測〔J〕.貴州醫藥，2015；39(3)：203-6.

9Ferré CA，Davezac N，Thouard A，etal.Manipulation of the N-terminal sequence of the Borna disease virus X protein improves its mitochondrial targeting and neuroprotective potential〔J〕.FASEB J，2016；30(4)：1523-33.

10雷以會，徐 平，楊利玲.貴州遵義地區82只健康蝙蝠腦組織博爾納病毒核蛋白檢測〔J〕.山東醫藥，2016；56(11)：23-5.

11McHugh JM，de Kloet SR.Discrepancy in the diagnosis of avian Borna disease virus infection of Psittaciformes by protein analysis of feather calami and enzyme-linked immunosorbent assay of plasma antibodies〔J〕.J Vet Diagn Invest，2015；27(2)：150-8.

12楊利玲，雷以會，徐 平.貴州遵義地區蝙蝠腦組織BDV-P24基因片段的檢測〔J〕.中國人獸共患病學報，2016；32(2)：156-9.

〔2017-07-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

R749

A

1005-9202(2017)19-4772-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.035

國家自然科學基金資助項目(No.31160210)

徐 平(1963-)，男，博士，主任醫師，主要從事神經內科研究。

張 麗(1981-)，女，碩士，主治醫師，主要從事神經內科研究。