產木聚糖酶的食用真菌菌株選育及條件優化*

邢振楠 孟慶彬 王丹麗 范冬茹 馬 珂

（伊春林業科學院，黑龍江 伊春 153000）

產木聚糖酶的食用真菌菌株選育及條件優化*

邢振楠 孟慶彬 王丹麗 范冬茹 馬 珂

（伊春林業科學院，黑龍江 伊春 153000）

采用木聚糖類似物誘導法，對64種食用真菌進行誘導培養，得到產木聚糖酶較高的食用菌株—黑木耳LK8。利用正交試驗法對黑木耳LK8的液體培養條件進行優化，結果顯示：在液體培養基pH=7.5、底物木聚糖濃度為1 g/100mL、培養20天的條件下產酶效果最佳，產酶水平為605.6 IU/mL，較優化前提高近7倍。同時，試驗結果證明培養液pH值是影響誘導效果的主要因素，利用鹽沉和冷凍干燥法制備木聚糖酶粗酶制劑，得率為43%。

木聚糖酶；食用真菌；誘導代謝；條件優化

木聚糖酶是一類能夠破壞植物纖維組織，降解半纖維素的一組酶的總稱，屬于水解酶、胞外酶類，具有可誘導性。目前已被廣泛應用于工業生產、動物飼料喂養、食品行業加工、能源開發、環境綜合治理、造紙行業以及功能性低聚糖制備等領域[1-2]。木聚糖酶產生菌主要來源于自然菌株，可通過誘變、蛋白質工程、基因工程等分子技術改變產酶基因，從而提高菌體木聚糖酶的分泌量。目前國內外的研究主要集中在利用工程化菌株生產木聚糖酶[3-6]，而利用大型食用真菌液體發酵生產木聚糖酶卻鮮有報道。因此，本研究用7種木聚糖結構類似物配制液體誘導培養基，對64株不同種的大型食用真菌進行誘導培養，以期篩選出產木聚糖酶能力較強的菌株，并確定最佳產木聚糖酶條件。同時，制備粗酶制劑，為木聚糖酶生產提供基礎數據，并為其理化性質研究做準備。

1 試驗材料

1.1 試驗菌種

64種大型食用真菌包括9株木耳 (黑木耳LK5、黑木耳 LK7、黑木耳 LK916、黑木耳 LK9、黑木耳LK10、黑木耳LK12、黑木耳LK15、黑木耳LK8、黑木耳—豐收)、16株香菇 (香菇L26、香菇L109、香菇 9608、香菇 2205、香菇 2206、香菇 939、福建 396、香菇 1363、香菇 856、香菇 236、香菇396、香菇 208、香菇 908、香菇美 236、香菇美 238、平菇洛加)、11 株靈芝(靈芝 s1、靈芝 s2、靈芝 s3、靈芝 s4、靈芝 s5、靈芝 s6、靈芝 s7、靈芝 s8、靈芝 s9、韓靈芝、紅靈芝)及28株其他品種大型真菌(硫磺菌、金耳、白靈菇、灰離、長根菇、杏鮑菇、血耳、大宗菇、豬苓、羊肚菇、柴臉菇、榆黃蘑、大球蓋菇、褶傘密環菌、灰樹花、塊根蘑、元蘑、白靈菇、玉田平菇、猴頭、茶樹菇、滑子菇、真姬菇、向陽2號、白金鎮、黃金針、華白平菇、茯苓)。

1.2 供試培養基及主要化學試劑

液體培養基(蛋白胨 2.0 g，酵母膏 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO41.0 g,KH2PO40.46 g)、木聚糖類似物(木聚糖、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉(CMCNa)、葡萄糖、木糖、微晶纖維素、可溶性淀粉)，3,5—二硝基水楊酸(DNS)試劑、檸檬酸—磷酸二氫鈉緩沖液(pH5)。

2 試驗方法

2.1 食用真菌液體培養

將培養基與7種木聚糖類似物（添加量為5 g/L）分別組合成為誘導培養基，分別將64種食用菌接種到培養基內，設置pH值為7.0，25℃、150 r/min的條件下進行液體搖瓶培養25天，測定培養后的酶活并比較產酶能力。

2.2 食用真菌產木聚糖酶的測定

采用透明圈快速檢測法[7]。篩選具有木聚糖酶的食用真菌菌株，DNS法[8]測量食用菌培養液的產木聚糖酶活力(1mL酶液在50℃，pH值5.0條件下，每分鐘水中木聚糖生成1μmol木糖還原物質的量定為1個酶活單位，以IU/mL表示)。

2.3 木聚糖類似物誘導法培養條件的優化

利用正交試驗法對黑木耳LK8的液體誘導培養條件進行優化，設計3因素3水平試驗，選用Lg(33)正交表，擬定的正交試驗因素與水平(表1)。

表1 試驗因素與水平表

2.4 粗酶制劑的保存

把經過鹽析、濃縮后得到的木聚糖粗酶用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥處理，得到粗酶制劑，為下一步木聚糖酶理化性質研究做準備。

3 結果與分析

3.1 產木聚糖酶菌株的篩選

通過透明圈快速檢測法初步檢測出48株食用真菌具有產木聚糖酶的能力，進一步通過DNS法檢測出，在不同誘導類似物誘導培養下，產木聚糖酶活力較高的5個食用真菌菌株分別是：香菇2205、靈芝、杏鮑菇、玉田平菇、黑木耳 LK8（表 2）。綜合各特征比較，黑木耳LK8透明圈直徑最大，DNS（OD600nm）數值高于其他菌株，在誘導培養條件下表現出較好的產木聚糖酶能力。因此最終選取伊春林業科學院保藏菌種黑木耳LK8進行液體培養條件優化試驗。

3.2 誘導培養條件的優化

由正交試驗結果分析（表3）可知：誘導培養黑木耳LK8產木聚糖酶最高的條件組合為a1b3c3，即最佳培養時間、pH值和底物木聚糖濃度（g/100mL）分別為20天、7.5和1 g/100mL；優化后測定產酶水平為：605.6 IU/mL。

由極差數據分析(表4）可知：黑木耳LK8受各因素影響的順序是，誘導培養液pH＞底物濃度＞誘導時間，其中pH值是主要因素。

表2 5種菌種經不同誘導處理產木聚糖酶情況

表3 正交試驗結果分析

表4 極差分析表

3.3 木聚糖酶提取結果

通過對黑木耳LK8的誘導培養條件的優化，酶活力得到了很大的提高，較之前的Themr ascusaurantaicus優化菌株[9]有較高的酶活及產率(表5)，利用鹽沉和冷凍干燥法，每1 000mL粗酶液可得到3.581粗酶粉，單位酶活為72 050.8 IU/g，總酶活為258 013.9 IU，得率為43%。

表5 黑木耳LK8木聚糖酶制劑的酶活力和得率

4 討論與結論

4.1 誘導菌株的篩選及培養條件的優化是誘導食用菌代謝生產木聚糖酶的關鍵技術，本試驗對64株大型食用真菌采用平板透明圈法和液體發酵誘導培養相結合的方法，篩選獲得1株產木聚糖酶較高的菌株，為黑木耳LK8。通過正交試驗對菌株黑木耳LK8的誘導培養條件進行了優化，確定了最佳產酶條件為：培養時間20天、pH值7.5、底物木聚糖濃度1 g/100mL。條件優化后菌株LK8產酶水平從原來的86.2 IU/mL提高到605.6 IU/mL，提高了近7倍；同時得出影響誘導效果的主要因素是培養液pH值；利用鹽沉和冷凍干燥法制備木聚糖酶粗酶制劑，每1 000mL粗酶液得3.581 g粗酶粉，單位酶活為72 050.8 IU/g，總酶活為258 013.9 IU,得率為43%。利用此誘導培養方法合成的木聚糖酶偏堿性，具有更廣闊的研究潛力和應用前景。

4.2 研究發現，誘導培養過程中食用菌菌絲體對培養基酸堿度要求差別很大，后續將就食用菌代謝生產的木聚糖的理化性質進行進一步研究，確定其理化性質及應用范圍，為木聚糖酶的應用積累數據。

4.3 試驗過程中菌絲生長前期產多糖比率較高，隨培養時間延長多糖比率有所下降，產酶能力則是隨菌絲代謝時間延長而增加，平衡產酶和產多糖時間點，是后續的主要研究內容。

4.4 誘導培養基質中的木聚糖類似物可誘導該酶的合成、增加該酶代謝量，此試驗正是基于利用食用菌生長代謝特性與木聚糖酶的合成特點而設計的。我國食用菌產量大，液體培養技術成熟，所以，探究大型食用真菌的深層研究價值，利用其生產木聚糖酶及相關酶系將成為未來科研的一個主要方向。

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［10］ 邢振楠，臧海蓮，王丹麗，等.誘導食用真菌代謝生產木聚糖酶的研究［J］.5(13):8-11，73.

（責任編輯：李 丹）

S 567.3

A

1001-9499（2017）05-0022-03

* 黑龍江省森林工業總局科技攻關項目（sgzjY2013015）

第1作者簡介：邢振楠（1981-），男，本科，工程師。 主要從事森林食品研究。

2017-05-29