‘嘎啦’蘋果花藥培養種質創新

溫鑫，鄧舒，張春芬，侯麗媛，石江鵬，聶園軍，肖蓉，秦永軍，曹秋芬,

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‘嘎啦’蘋果花藥培養種質創新

溫鑫1，鄧舒3，張春芬3，侯麗媛2，石江鵬1，聶園軍4，肖蓉3，秦永軍2，曹秋芬1,2

（1山西大學生物工程學院，太原 030006；2山西省農業科學院生物技術研究中心，太原030031；3山西省農業科學院果樹研究所，山西太谷030815；4山西省農業科學院農業資源與經濟研究所，太原030031）

【目的】單倍體花藥離體培養是農作物包括果樹育種中種質資源創新的最有效方法之一，蘋果是染色體高度雜合且自交不親和樹種之一。在當前蘋果主栽品種中，‘嘎啦’具有早熟、豐產、穩產、多抗的優良性狀，是蘋果育種的重要種質資源之一。花藥單倍體育種也是蘋果新品種培育的重要手段。本研究通過‘嘎啦’蘋果花藥培養誘導胚狀體并獲得純合再生植株，為創制新的純合體種質資源，加速蘋果新品種培育進程提供材料。【方法】采集‘嘎啦’蘋果單核靠邊期到雙核早期的花藥（未開放的花蕾）, 低溫處理后進行離體培養，經胚狀體誘導，分化培養形成再生苗，再經生根培養獲得花藥再生植株。之后利用FACS流式細胞儀對再生植株進行倍性分析。取再生植株葉片分離DNA，選用80個來源于蘋果HIDRAS數據庫的SSR標記對所有植株進行PCR擴增，經過凝膠電泳和熒光毛細管電泳鑒定再生植株純合基因型。移栽成活后，對每個再生株系進行形態學特征觀察及統計分析。【結果】過去3年中，共接種的74 200個‘嘎啦’花藥，從未被污染的5萬多個花藥中成功誘導形成386個胚狀體（胚狀體誘導率0.7%），經分化培養獲得64株再生苗（植株再生率16.6%），最終經生根培養、移栽獲得30個成活再生株系。其中包括28個二倍體株系，1個單倍體株系和1個四倍體株系。SSR標記用于純合性鑒定，PAGE結果表明再生株系均為花粉（小孢子）單倍體細胞來源。為了鑒定這些再生植株基因型，從80個SSR中篩選出17個SSR標記（其余SSR標記不具有多態性或帶型雜亂）對所獲得的30個再生株系進行基因型鑒定。17個SSR標記所對應的PCR擴增物能有效區分鑒定不同再生植株基因型。繼代培養60 d后的形態學觀察顯示不同再生株系的株高、葉長、葉寬等特征差異明顯。不同二倍體純合植株的植物學特征也存在差異：Gala 5植株相對較高，葉基變寬，葉尖漸尖；Gala 7葉片變小、變厚，葉柄變短且基部寬大，葉色深且有很強的光澤度；Gala 18葉片較小，葉數較多。純合二倍體再生植株長勢弱于‘嘎啦’雜合供體，但強于單倍體和純合四倍體。【結論】采用優化花藥培養技術，成功獲得了一批蘋果純合體再生植株種質并建立了SSR標記鑒定體系。這些新的種質很大程度豐富了蘋果育種親本種質資源，為挖掘‘嘎啦’蘋果優良性狀基因提供了重要材料，為后期的田間性狀篩選，雜交育種奠定了基礎。

‘嘎啦蘋果’；花藥離體培養；單倍體育種；SSR標記；純合基因型

0 引言

【研究意義】單倍體育種是首先通過雄核發育（包括離體花藥培養/小孢子培養）或孤雌生殖方法誘導形成單倍體植株，然后經染色體加倍形成純合二倍體，其中具有優良性狀的可育再生植株可作為新的育種材料。單倍體育種能加快獲得某一性狀純系，更重要的是極大豐富了親本種質資源，從而更好的實現倍性育種，加快育種進程[1-3]。花藥培養是單倍體育種的主要途徑之一，自然加倍形成的純合二倍體植株則是挖掘特有性狀基因、研究遺傳基礎及蘋果分子標記輔助育種的理想材料[[4-8]。蘋果（Brokh）是世界上最重要的果樹之一[9]，中國蘋果產量居世界首位[10]。蘋果基因型高度雜合、異花授粉且自交不親和[11]，難以通過常規雜交育種獲得純合基因型植株，所以很大程度增加了蘋果單倍體育種難度[12-13]。通過花藥離體培養快速挖掘雜合體‘嘎啦’優良性狀基因是蘋果育種中種質創新的重要內容。【前人研究進展】自首次采用花藥培養獲得單倍體植株以來[14]，目前已有250多種植物利用單倍體育種方法獲得再生植株[15]。20世紀70年代，Nakayama等[16]率先開始蘋果花藥培養，之后多個蘋果品種的花藥經培養誘導獲得了胚狀體[17]以及純合基因型植株[18]。依靠花藥培養技術，楊振英等[19]育成蘋果新品種‘華富’。Okada等[20]則獲得了‘千秋’純合可育再生植株。這些蘋果花藥培養再生植株，很大程度豐富了單倍體育種種質資源[21]，擴大了育種親本范圍。但是純合再生植株育性和結實率很低，直接用于雜交育種還有一定的困難。任瑩[22]通過蘋果花藥培養獲得22個再生株系，同時證明γ射線輻射后會影響結果率、果實大小和種子育性。Zhang等[23]選用SSR標記證實‘紅星’和‘千秋’蘋果花藥培養再生植株來源于花粉。近期的蘋果花藥轉錄組測序研究證明多種植物激素信號轉導相關基因是影響花藥胚性潛能的關鍵因子[24]。在花藥培養誘導形成胚狀體的細胞學研究方面，馮麗云等[25]證明改良脫水流程能強化胚發育的細胞學觀察。【本研究切入點】蘋果‘嘎啦’（橘紅×金冠）是當今全球最重要的蘋果栽培主流品種之一。但‘嘎啦’蘋果的花藥離體培養未見報道。【擬解決的關鍵問題】當前限制蘋果育種的關鍵因子之一就是缺乏優良性狀基因，比如抗逆、抗病的純合親本材料。本研究旨在以優良雜合體‘嘎啦’為試驗對象，采用花藥單倍體培養獲得一批再生株系純合體，通過流式細胞儀分析染色體，繼而應用蘋果SSR標記鑒定基因型，建立SSR標記的再生植株基因型鑒定體系，從而創制新的蘋果育種種質資源，為后期的蘋果育種包括田間性狀篩選、雜交提供豐富的育種材料。

1 材料與方法

1.1 花藥離體培養

2013—2015年每年4月初，采取山西省農業科學院果樹研究所蘋果圃的‘嘎啦’蘋果未開放的花蕾（此時花藥多處于單核晚期到雙核早期[23]）。花蕾經4℃低溫預處理26—32 d，用75%酒精消毒（振蕩漂洗）30 s，后用無菌水沖洗3—4次，再用0.5%的次氯酸溶液滅菌8 min，無菌水沖洗3—4次，放置于已滅菌的濾紙上待接種。剝取花藥按50個/皿的密度接種于胚狀體誘導培養基（N6培養基，附加2.0—3.0 mg·L-16-BA和0—0.15 mg·L-1NAA），25℃恒溫培養箱內進行暗培養，誘導胚狀體形成，轉移胚狀體至分化培養基，后經繼代培養、生根培養、馴化、室內移栽獲得再生植株。

1.2 染色體倍性分析

取再生植株葉片在500 μL裂解液中用刀片切碎，靜置2 min后過濾于EP管中，PI染色后用BD Accuri C5 流式細胞儀分析葉片中的DNA含量。以莖尖培養獲得的雜合二倍體‘嘎啦’試管苗葉片為倍性鑒定的參考標準。

1.3 基因組DNA的提取

采用改良CTAB法提取葉片總DNA[26]，經核酸蛋白儀（Bio-Rad）檢測DNA濃度，再經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質量。

1.4 SSR標記篩選

從蘋果HIDRAS數據庫（http://www.hidras. unimi.it/）選定位于17個連鎖群（Linkage Group，LG）的80個SSR標記，相應引物由華大基因合成。以雜合體‘嘎啦’葉片和再生株系葉片的DNA為擴增模板，使用80對SSR引物進行PCR擴增。PCR反應體系為15 μL，含dNTP mixture（2.5 mmol·L-1）1.2 μL、正向引物和反向引物（10 μmol·L-1）各1.5 μL、10×PCR Buffer（Mg2+）1.5 μL、rTaq酶（5 U·μL-1）0.15 μL、DNA 模板50 ng。PCR儀（Eppendorf AG 22331 Hamburg, Germany）反應程序為：94℃預變性150 s；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸4 s，35 個循環；72℃充分延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物加入7.5 μL（2﹕1）的上樣緩沖液，在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上電泳100 min（150 A）左右，銀染檢測擴增產物，篩選擴增穩定、帶型清晰、可區分雜合親本與純合再生株系的SSR標記。

1.5 再生株系的基因型鑒定

對篩選得到引物的5′端TAM、FAM、HEX熒光標記，進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，含dNTP mixture（10 mmol·L-1）0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol·L-1MgCl22.0 μL、rTaq酶（5 U·μL-1）0.2 μL、DNA模板（100 ng·μL-1）1 μL、ddH2O 17.8 μL。PCR反應程序為：第一步95℃預變性3 min；第二步94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環；第三步95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個循環；第四步72℃充分延伸6 min，4℃保存。反應板每孔先加入9.9 μL去離子甲酰胺和0.1 μL ROX500或LIZ500分子量內標，再吸取50 pg擴增產物加入樣品孔中。98℃變性5 min，急速冷卻，放置于ABI 3730XL DNA分析儀上。使用Gene Mapper軟件分析擴增片段峰型并讀取相應數據。

1.6 再生株系植物學觀察

以‘嘎啦’供體（雜合二倍體）為對照，對胚狀體分化出再生苗后繼代培養60 d的再生株系進行形態學特征（包括株高、葉形、葉數、葉長寬比）觀察和統計。

2 結果

2.1 ‘嘎啦’花藥培養再生植株獲得

共接種74 200個‘嘎啦’花藥。經統計，未被污染的花藥數55 143個（未污染率74.3%），誘導形成386個胚狀體（胚狀體誘導率0.7%，圖1-A），經過胚狀體經分化培養后共獲得64株再生苗（植株再生率16.6%，圖1-B），之后經生根培養（圖1-C）、室內移栽，最終獲得30個花藥培養再生株系（圖1-D）。

圖1 ‘嘎啦’花藥培養再生株系

2.2 再生株系倍性分析

采用流式細胞儀對成活再生株系進行染色體倍性鑒定。以雜合二倍體‘嘎啦’供體（圖2-A）為對照，結果表明，再生株系呈現3種不同的倍性，其中株系Gala 17為單倍體（圖2-B），Gala 22株系為四倍體（圖2-C）外，其余28個再生株系包括Gala 5（圖2-D）均為二倍體。

2.3 SSR標記分析

為了鑒別再生株系是純合還是雜合體，首先對選自蘋果SSR標記數據庫（HIDRAS）的80個SSR標記進行篩選。用每一個SSR引物進行PCR擴增，然后根據擴增條帶鑒別染色體來源。結果顯示，80個SSR標記中有20個可區分純合體/雜合體，擴增產物穩定，擴增片段長度在100—300 bp。如圖3（Hi12c02（LG1）標記）聚丙烯酰胺凝膠電泳結果所示，‘嘎啦’雜合供體呈現2條PCR擴增帶（170 bp和190 bp），而30個再生株系均只顯示其中1條帶，13個株系顯示170 bp，其余17個株系為190 bp。20個標記如表1所示：LG4、LG9、LG14均篩得兩個標記，其余連鎖群各有一個標記。

圖2 流式細胞儀對再生植株倍性分析

圖3 Hi12c02（LG1）PCR擴增產物在PAGE的電泳圖結果

2.4 再生植株基因型鑒定

進一步從LG4、LG9、LG14中各選擇一個帶型清晰的標記，與其余13個標記（另外13個連鎖群）共17個SSR標記，利用熒光毛細管電泳技術鑒定PCR產物。圖4（Hi12c02（LG1）標記）可見，‘嘎啦’雜合供體呈現176 bp和189 bp峰值，而純合再生株系則只有其中一個峰值，其中13個再生株系呈現峰值176 bp，另外17個則呈現189 bp峰值，其他16個連鎖群上的16個SSR標記也同樣顯示雜合體為兩個峰，而再生株系只有其中的一個峰。此結果與上述聚丙烯酰胺凝膠電泳結果一致。證明，再生株系除單倍體gala17外，所獲其他29個再生株系均為純合基因型植株。

表1 蘋果HIDRAS數據庫SSR 標記

雖然一個SSR能鑒別雜合體或純合體，但是不足以鑒定純系間的基因型。因此采用一組SSR標記來鑒定基因型。從20個SSR選出的17個SSR（每個連鎖群一個），利用熒光毛細管電泳技術用來鑒別植株的基因型。如表2所示，根據不同的產物大小組合，這17個SSR譜（組合）完全可以把所有30個植株鑒別。比如Gala03基因型可以用SSR擴增條帶176 bp-176 bp-128 bp-153 bp-221 bp-193 bp-286 bp-112 bp-196 bp-124 bp-151 bp-134 bp-142 bp-158 bp-143 bp-149 bp-237 bp序列來表示，相當于植株的條形碼。這種SSR 產物序列可以用于獲得的‘嘎啦’花藥植株純合體種質資源鑒定，同時也是一種分子育種標記物。另外，發現部分株系在部分位點上存在變異：即未擴增出條帶，或大小與親本不一致。比如Gala01（189 bp-140 bp-119 bp-159 bp-175 bp-193 bp-286 bp-112 bp-196 bp-177 bp-0-149 bp-142 bp-141 bp-143 bp-130 bp-244 bp）在LG10未擴增出條帶（用‘0’表示），Gala02、Gala14同在LG10未擴增條帶；Gala07（176 bp-140 bp-119 bp-159 bp-221 bp-193 bp-238 bp-120 bp-196/229 bp-124 bp-141 bp-134 bp-142 bp-141 bp-143 bp-149 bp-244 bp）在LG9擴增異常。上述篩出的17個SSR標記譜（組合）能同時區分鑒定每個純合植株的基因型，30個再生株系均為不同基因型的蘋果新種質。這些SSR標記（每個連鎖群一個SSR標記）為后期田間嫁接育種種質資源來源及新的‘嘎啦’蘋果純合基因型種質的鑒定提供了依據。

2.5 再生株系形態學觀察

表3結果顯示‘嘎啦’雜合供體株高為5.67 cm（n=1），純合二倍體平均株高2.96 cm（n=28），比純合四倍體為1.90 cm（n=1）和單倍體為2.53 cm（n=1）略高。同時也觀察到純合二倍體長勢相對于嘎啦雜合供體較弱。不同二倍體純合植株的植物學特征也存在差異，如圖5所示，Gala05植株相對較高，葉基變寬，葉尖漸尖；Gala07葉片變小、變厚，葉柄變短且基部寬大，葉色深且有很強的光澤度；Gala18葉片較小，葉數較多。

橫坐標：擴增片段大小；縱坐標：熒光信號強度。G：‘嘎啦’供體；1-30：‘嘎啦’花藥再生株系

the abscissa indicates the sizes of amplified fragment and the ordinate shows the intensity of fluorescence signal. G: ‘Gala’ Heterozygote; 1-30: Regenarated plantlets of ‘Gala’ by anther culture

圖4 Hi12c02（LG1）PCR擴增產物用毛細管電泳熒光檢測法檢測結果

Fig. 4 Hi12c02（LG1） PCR fragment detected by capillary electrophoresis with fluorescence detection

表2 ‘嘎啦’花藥再生植株SSR標記鑒定

表3 再生株系形態學觀察

圖5 嘎啦花藥培養再生植株的形態學觀察

3 討論

本研究的主要目的是通過花藥培養獲得純合體再生植株豐富蘋果育種親本材料。蘋果單倍體育種技術，尤其用花藥離體培養誘導胚狀體形成純合基因型再生植株的研究仍存在較多問題。在技術上，采用了先前優化的花藥培養種技術。試驗結果表明，‘嘎啦’花藥培養胚狀體誘導率以及再生植株率都比較低。根據前人研究，花藥培養研究低胚誘導率和植株再生率受到供體基因型、取樣時間、培養基成分、培養條件（如光照、溫度等）等多種因素影響[27-28]。其中供體基因型是最重要的影響因子[29]。就培養條件而言，H?fer等[30]則證明花藥先于27℃暗培養適當時間后轉入23℃正常光下培養能提高蘋果胚誘導率。此外，低溫預處理可有效提高胚誘導率[31]。本研究采用的是前期優化后的培養條件，包括在胚誘導培養基N6附加L6-BA、NAA和活性炭等成分[22]。

一般來說在花藥離體培養過程中，尤其是在愈傷組織誘導階段，再生植株染色體倍數可能發生變化[32]，導致花藥培養誘導形成的再生植株呈現單倍體、二倍體、多倍體和混倍體[33]。本研究的倍性分析結果和前人的研告類似。在獲得的30個花藥培養再生株系，結果顯示有單倍體、二倍體、四倍體，其中28株為純合二倍體株系（93.3%）。二倍體和四倍體再生株系經過SSR鑒定均是單倍體自然加倍得到的純合株系，這些二倍體的純合株系可能由于單倍體細胞發生了核融合或核內加倍[34]。這種倍性多樣性與H?fer等[29]的研究相同。

單倍體育種是獲得優勢親本供體材料的最有效方法之一。花藥的花藥壁是雜合體細胞，同時也可能誘導成雜合二倍體的再生植株，所以獲得的二倍體植株并非一定為純合體。通過鑒定再生植株的等位基因就可以把花藥培養再生植株的雜合二倍體和純合二倍體區分開。以前的技術包括同工酶標記[35]、S等位基因[36]及SSR分子標記[18,20,23,27]都曾被應用于花藥再生植株的純合性鑒定。本研究也采用了SSR鑒定方法。首先選用的80個SSR標記（來自HISDAS）對所有的再生植株進行PCR，篩出20個可區分再生植株為純合的SSR標記。為了進一步區分再生植株的基因型，又篩選出分布于蘋果17個連鎖群的17個SSR標記。這17個SSR標記能明確標記‘嘎啦’蘋果不同的植株，為今后進行‘嘎啦’蘋果的基因型鑒定提供了技術指標。目前選出的SSR標記是低密度的SSR標記手段，這些低密度的SSR不能完全應用到所有‘嘎啦’蘋果的后代植株，因此在鑒定30個‘嘎啦’蘋果花藥培養再生株系時出現了個別株系沒有條帶的現象，今后可能會獲得一些新的植株，還需要增加新的不同SSR標記來鑒定這些株系的來源，這也是SSR標記的一個普遍技術局限性。隨著高通量測序技術的普及，全基因組測序的成本降低，進行全基因組范圍內的測序開發SNP標記是替代SSR標記的必然趨勢，近年來，一種更加快速、簡易和低成本的基因分型技術GBS（Genotyping-by- Sequencing）能有效的開發大規模的SNP標記[37]，結合現有的SSR技術可以在全基因組范圍內快速挖掘‘嘎啦’蘋果的基因資源。

研究表明，花藥再生植株的植物學特征呈現多樣化。單倍體育種所獲純合植株雖然失去了雜種優勢，出現不同程度返祖現象，其價值在于可作為遺傳研究的基礎材料，后代雜交種也許會表現出更強的雜種優勢。而純合二倍體之間的差異源于花粉母細胞減數分裂時（在不發生交換的情況下）非同源染色體（非等位基因）自由組合，應有217個基因重組類型，加之培養過程中可能誘導基因突變，使花藥培養后代的表型差異顯著，遺傳變異類型較常規雜交后代更豐富[2]。再生植株的植物學特征也應證了這些發現。對花藥培養試管苗的葉形、株高、葉長、葉寬等的評價結果顯示，不同倍性的再生植株差異顯著；即使同為純合二倍體再生植株，其植物學性狀也有差異。通常來看雜合供體的生長優于單倍體以及其他倍性植株[38]。從育種和生產實踐而言，蘋果以二倍體和三倍體的生長勢最強。對再生植株組培苗的植物學觀察同樣發現，無論是純合二倍體或者其他倍性植株長勢均弱于雜合供體植株，這是因為喪失了雜種優勢。當然，觀察的是組培苗，植株育性有待于后期進一步觀察。

4 結論

獲得了30個‘嘎啦’花藥再生株系并用SSR標記對每個植株進行了基因型鑒定，早期的植物學觀察顯示再生株系株高、葉長、葉寬等呈現多樣性。鑒于蘋果基因型高度雜合，生長周期長，蘋果花藥培養植株獲得率極低，獲得的再生株系以及SSR鑒定體系對分析鑒定‘嘎啦’優良性狀基因研究，田間嫁接、雜交育種，以及表型-基因型關聯分析具有重要意義。

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（責任編輯趙伶俐）

Regeneration of New Germplasms Using Anther Culture of Apple Cultivar ‘Gala’

WEN Xin1, DENG Shu3, ZHANG ChunFen3, HOU LiYuan2, SHI JiangPeng1, NIE YuanJun4, XIAO Rong3, QIN YongJun2, CAO QiuFen2

(1College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006;2Biotechnology Research Center, Shanxi Academy of Agriculture Sciences, Taiyuan 030031;3Shanxi Academy of Agricultural Sciences Pomology Institute, Taigu030815, Shanxi;4Agricultural resource and Economic Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031)

【Objective】Anther culture is one of the most effective techniques to create new germplasms in modern breeding. Apple is one of the most highly genetically heterozygous and self-incompatible fruit tree. Among the current major apple germplasms, ‘Gala’ cultivar shows traits of early maturity, high yield and enhanced anti-biotic stress, thus is a very important genetic resource for apple breeding programs. Haploid breeding has already been employed to regenerate new germplasm in apple breeding research. In this study, the plantlets were regenerated through embryogenesis during “gala” cultivar anther culture lines to enrich parental apple breeding germplasms. 【Method】The anther culture was used to regenerate gala plants. The ploidy level of regenerated plantlets was determined using flow-cytometry. Subsequently, using selected SSR (HIDRAS) markers, the genotypes of regenerated lines were characterized by gel electrophoresis as well as fluorescent capillary electrophoresis. The anther of ‘Gala’ cultivar collected at early stage were firstly treated at low temperature and then culturedthrough embryos induction and differentiation phases and the regenerated plantlets were obtained. The ploidy levels of regenerated plants were analyzed using FACS flow cytometry. To identify the genotype of the plantlets, the DNA was isolated from leaves and then subjected to PCR amplification based on 80 SSR primers selected from the apple HIDRAS database. The homozygous genotypes were determined using both gel electrophoresis and fluorescence capillary electrophoresis. After transplantation, the morphological characteristics of each regenerated plantlet were analyzed.【Result】In the past 3 years, by using the previously optimized anther culture technology, a total of 74 200 ‘Gala’ anthers were inoculated with embryo induction of 0.7% (contaminated anthers over 50 000), resulted in 386 embryos. With differentiation culture, 64 regenerated plantlets survived with regeneration rate of 16.6%. After root induction phase, finally 30 regenerated lines including 28 diploids, 1 haploid and 1 tetraploid were obtained. The PAGE analysis showed that all the regenerated lines were originated from haploid pollen. For genotyping these regenerated plantlets, 17 of 80 SSR markers were further selected (the remaining SSR markers were not polymorphic thus cannot be used for the genotyping) for PCR amplification. Results showed that the panel of 17 SSRs each located in 17 linkage groups, respectively, well distinguished genotypes of the 30 individual regenerated lines. Subsequent morphological observation at the time of 60 days subculture showed that the height of plantlets and morphology of the leaves varied largely. In addition, variations regarding variant ploidy levels were also observed: Gala 5 line was relatively high with wider leaf base, while Gala 7 line showed smaller and thicker leaves and Gala 18 line showed smaller leaves and less amount of leaves. Moreover, diploid plantlets showed a trend of weaker growth than that of the parental ‘Gala’ but stronger than that of haploid and homozygous tetraploid.【Conclusions】By using the technique of anther culture, a set of apple germplasm was successfully obtained and a SSR marker identification system was established. More importantly, the regenerated lines have greatly enriched the apple germplasms and will lay a foundation for apple haploid breeding.

Gala; anther culture; haploid breeding; SSR markers; homogeneous genotype

2017-01-12；接受日期：2017-03-10

國家自然科學基金（31372033）、國家科技基礎性工作專項（2012 FY110100-5）、山西省青年科技研究基金（201502115，201601D202068）、山西省農業科學院種業發展專項（2016zyzx35）

溫鑫，E-mail：18234061314@163.com。通信作者曹秋芬，E-mail：qiufengcao@163.com