基于表達譜芯片挖掘雞骨骼肌不同類型肌纖維的 差異表達基因

束婧婷，姬改革，單艷菊，章明，肖芹，屠云潔，盛中偉，張笛，鄒劍敏

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基于表達譜芯片挖掘雞骨骼肌不同類型肌纖維的 差異表達基因

束婧婷，姬改革，單艷菊，章明，肖芹，屠云潔，盛中偉，張笛，鄒劍敏

（江蘇省家禽科學研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州 225125）

【目的】肌纖維類型的差異是直接影響肌肉生長發(fā)育和肉品質的重要因素，紅肌纖維比例高的肌肉肉品質要顯著優(yōu)于白肌纖維比例高的肌肉，然而，目前對于雞骨骼肌纖維類型形成及轉換的分子調控機制尚不明確。本究以中國優(yōu)良的地方品種清遠麻雞為研究對象，首次對其骨骼肌中不同類型肌肉的轉錄組差異進行了研究，以期挖掘在雞肌纖維生成和類型轉換中發(fā)揮調控作用的關鍵因子?！痉椒ā坎捎肁gilent雞全基因組表達譜芯片對清遠麻雞骨骼肌表型差異較大的比目魚肌和趾長伸肌中與肌纖維類型組成和轉換相關的候選基因進行系統(tǒng)篩查，采用熒光定量PCR對芯片篩選出的差異表達基因進行驗證，采用慢病毒質粒包裝系統(tǒng)構建特異靶向雞PPARGC1A基因的RNA干擾慢病毒載體進行基因功能研究?！窘Y果】芯片結果共發(fā)現差異倍數在2倍及以上的基因1 224個(<0.05, FC≥2)，以趾長伸肌作為參照，比目魚肌中上調基因為654個，下調基因為570個，盡管芯片和熒光定量PCR兩種方法得出的差異倍數并不完全一致，但所選基因的表達趨勢是一致的，表明芯片結果是可靠的。對差異表達基因進行GO（GO ontology）功能分類，共發(fā)現了74個顯著性GO，主要分為生物學過程、分子功能和細胞組分等3大類?；贙EGG Pathway分析發(fā)現，一些已知的與肌纖維類型轉換、肌肉發(fā)育以及脂質代謝相關的信號通路在兩種類型的肌肉中被顯著富集。綜合差異基因的GO、KEGG Pathway和共表達網絡分析，推測PRKAG3, ATP2A2以及PPARGC1A可能是與肌纖維類型性狀緊密關聯(lián)的關鍵基因。進一步對PPARGC1A基因進行功能研究發(fā)現，PPARGC1A基因的敲低，引起了PPP3CA，MEF2C以及SM等慢肌纖維標志基因以及與肌纖維發(fā)育與轉換相關基因表達水平的顯著降低，而快肌纖維標志基因FWM的表達水平則顯著上升?！窘Y論】揭示了雞紅肌和白肌兩種不同類型肌肉間的轉錄組差異，證明了PPARGC1A基因能夠與鈣離子信號通路相關基因協(xié)同從而在雞肌纖維類型組成和轉換中發(fā)揮著重要作用，從而為中國地方雞肉品質性狀的遺傳改良提供一定的理論依據。

表達譜芯片；轉錄組差異；肌纖維類型；PPARGC1A；雞

0 引言

【研究意義】骨骼肌是雞胴體中最主要的組成部分，約占體重的50%，它不僅是運動器官，更是內分泌系統(tǒng)的重要組成部分，參與整個機體代謝的調節(jié)[1]。肌纖維是構成肌肉組織的基本單位，根據外觀、收縮特性和代謝特征可將雞骨骼肌纖維分成氧化型纖維（I型和IIa型，色紅，進行有氧代謝）和酵解型纖維（IIb型，色白，進行酵解代謝）[2]。研究表明，肉的產量和質量都與肌纖維的生長和組成密切相關，肌纖維類型的差異是直接影響肌肉生長發(fā)育和肉品質的重要因素[3]，氧化型肌纖維比例高的肌肉肉品質要顯著優(yōu)于酵解型肌纖維比例高的肌肉[4]，在雞上，比目魚肌以氧化型肌纖維為主，而趾長伸肌和腓腸肌外側頭則以酵解型肌纖維為主。動物骨骼肌纖維類型組成并不是完全固定的，它們會隨著骨骼肌對代謝與功能需求的改變而發(fā)生改變。因此，研究肌纖維生長發(fā)育及類型組成和轉換的分子機理，挖掘在肌纖維生成和類型轉換中發(fā)揮調控作用的關鍵因子將對雞肉品質的遺傳改良提供新的思路和策略。【前人研究進展】目前，國內外在肌纖維類型形成及其轉換相關的分子遺傳學方面已開展了一定的研究，并發(fā)現IGF-I-鈣調磷酸酶-NFAT信號途徑可能是調節(jié)肌肉生長、決定不同肌纖維類型的主要信號途徑[5-6]。然而，肌纖維類型的發(fā)生與轉換受到許多信號通路、基因與轉錄因子的調控，是一個非常復雜的調控過程，因此，很有必要在全基因組水平挖掘和篩選與肌纖維生長發(fā)育和類型組成相關的基因和信號通路?；蛐酒夹g由于能夠同時檢測出某個特定組織中的大量差異表達基因而被廣泛應用于生命科學研究等領域[7]。許多學者也在轉錄水平對不同物種中決定氧化型和酵解型肌纖維差異的機理進行了研究。CAMPBELL等采用Affymetrix芯片在雌鼠紅肌和白肌中共發(fā)現了49個差異表達基因[8]。BAI 等采用豬骨骼肌cDNA芯片對22周齡約克夏豬腰?。t?。┖捅匙铋L?。ò准。┻M行了差異表達基因篩選，結果發(fā)現了一批在肌纖維類型組成中可能具有重要作用的候選基因[9]。LI等對梅山豬紅肌和白肌組織進行轉錄組分析，結果發(fā)現了包括胰島素信號通路和細胞周期通路在內的與不同肌纖維類型代謝特征相關的28條信號通路[10]。在雞上，ZHENG等對不同發(fā)育時期蛋雞和肉雞胸肌的差異表達基因進行了篩選，發(fā)現了調控肌肉生長速度的一些關鍵基因[11]。本課題組前期采用Aligent表達譜芯片對清遠麻雞和科寶肉雞比目魚肌進行了差異表達基因和信號通路的篩選，共篩選到差異基因1 318個，主要涉及到肌肉發(fā)育、能量代謝、脂質代謝等生物學過程[12]?！颈狙芯壳腥朦c】盡管前人在哺乳動物不同類型肌肉組織轉錄水平上的差異研究取得了階段性進展，但在全基因組表達水平上對雞骨骼肌表型差異的分子調控機理研究尚未見相關報道?！緮M解決的關鍵問題】清遠麻雞是中國著名的地方雞品種，素以皮色金黃、肉質嫩滑、皮脆爽、骨軟、風味獨特而馳名于粵港澳市場。本研究以清遠麻雞為研究對象，采用Agilent雞全基因組表達譜芯片（4×44K，Design ID：026441）對比目魚肌和趾長伸肌進行差異表達基因篩選，通過對差異基因進行GO，KEGG信號通路以及共表達網絡分析，確定與肌纖維生長發(fā)育及類型組成相關的新候選基因，并進一步通過慢病毒介導的基因干擾技術進行基因功能的驗證。研究結果將為優(yōu)質雞肉品質性狀遺傳改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

試驗于2015年3—12月在江蘇省家禽科學研究所下屬的江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室進行。

1.2 試驗動物

清遠麻雞來自于廣東天農食品有限公司清遠麻雞原種場，在同樣的飼養(yǎng)管理條件下飼養(yǎng)至性成熟日齡（112d，平均體重1 330g），隨機選擇體重相近的全同胞母雞3只進行屠宰。屠宰后，立即采集兩側趾長伸肌和比目魚肌，其中右側比目魚肌和趾長伸肌中間1 cm×1 cm部分用于肌纖維性狀的測定，左側相同部位樣品用于RNA抽提和芯片分析，所有樣品均置于液氮速凍，然后轉入-80℃冰箱保存。

1.3 肌纖維性狀組織學測定

在恒溫冷凍切片機內進行冰凍切片的制作，每個樣品在垂直于肌纖維延展方向做10張連續(xù)橫切切片，切片厚度12 μm。采用ATPase堿孵育法進行肌纖維類型、肌纖維密度、肌纖維直徑和面積的判定，在經典的Guth-Samaha法[13]基礎上改良后進行染色，全部試劑均新鮮配制。

1.4 RNA提取、質量檢測及純化

采用mirVanaTMRNA提取試劑盒（Applied Biosystemp/n AM1556）提取比目魚肌、趾長伸肌和成肌細胞總RNA，用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent）對總RNA進行質量檢測，合格后使用QIAGEN RNeasy?Mini Kit（QIAGEN）和RNsae-Free DNase Set（QIAGEN）純化總RNA，采用Agilent Bioanalyzer2100（Agilent Technologies）檢測RNA完整性，本試驗所有樣品RIN值均大于9，符合檢測要求。

1.5 芯片雜交

基因表達譜芯片采用Agilent公司的雞全基因組4×44K芯片（Design ID：026441），探針數量為43 803。芯片雜交及數據處理由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成。采用Low Input Quick Amp Labeling Kit, One-Color試劑盒（Agilent）對總RNA進行放大和標記；總RNA經第一鏈和第二鏈合成得到cRNA，Cyanine-3-CTP（Cy3）標記cRNA鏈后，用QIAGEN RNeasy Mini kit（QIAGEN）純化標記后的cRNA；芯片雜交采用Agilent表達譜芯片配套試劑盒；采用Agilent Microarray Scanner進行掃描，分辨率為5 μm，掃描儀自動以100%和10%PMT各掃描1次，以Agilent自動合并2次結果作為最終結果；采用Feature Extraction Software（version10.7.1.1, Agilent Technologies）讀取數據，Genespring Software（version 12.5; Agilent Technologies）進行歸一化處理，算法為Quantile。所有操作均按試劑盒說明和Agilent表達譜芯片實驗操作和分析手冊進行。

1.6 熒光定量PCR

為驗證芯片的結果，本研究選擇了9個差異表達基因，根據GenBank中的基因序列設計引物（表1）。參與芯片雜交的比目魚肌和趾長伸肌總RNA同樣用于熒光定量PCR驗證試驗。采用SYBR Green I法進行熒光實時定量PCR反應，以GAPDH基因作為內參基因進行數據的標準化處理，反應體系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol·L-1），cDNA 模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 7.8 μL補足20 μL。反應條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，擴增后經熔解曲線檢測特異性。每次反應均設空白樣品為陰性對照，每個樣品設置3個重復。相對定量的結果采用2-△△Ct法進行計算。采用Pearson’s相關檢驗對基因芯片和qRT-PCR 2種方法的結果進行相關性分析。

表1 熒光定量PCR引物

1.7 PPARGC1A基因shRNA載體構建、細胞分離培養(yǎng)及轉染

根據PPARGC1A基因序列（NM_001006457.1）設計并合成4對shRNA片段，分別為shRNA-563（5′GCAATAAAGCGAAGAGCATTT3′），shRNA-926（5′GGACTTCACCTAAGCCGAAGT3′），shRNA-驗1317（5′GCAGGGATCCCAAGGTAATAA3′）andshRNA-1688（5′GCT CTAGATCAAGGTCCTTTC3′），同時設計了NC shRNA作為陰性對照：5′ TTCTCC GAACGTGTCACGTTTC3′，由上海吉瑪基因股份有限公司完成。

成肌細胞分離自10胚齡的清遠麻雞，分離方法參照LI等[14]。細胞計數后調整濃度至1×106個/mL，接種于6孔板中培養(yǎng)。待細胞生長至70%—80%融合時進行轉染，48h后觀察細胞轉染情況，72h后收集細胞提取RNA進行熒光定量PCR，發(fā)現shRNA-1317轉染效率最高，故將其用于轉染正式試驗。轉染后96h收集細胞，采用熒光定量PCR檢測細胞中與肌纖維生長發(fā)育與類型轉換相關基因SM，FRM，MEF2C，NFATC3和PPP3CA的表達變化（表1）。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SAM3.0軟件篩選差異表達基因，篩選標準為≤0.05，同時變化倍數≥2或≤0.5。采用GOEAST軟件對差異表達基因進行基因功能分類（Gene ontology, GO），KEGG數據庫（http://www.genome. jp/kegg/），利用Fisher精確檢驗和卡方檢驗對差異基因參與的Pathway進行顯著性分析，按照value<0.05進行篩選得到顯著性的Pathway。采用cytoscape3.3軟件對差異基因進行共表達網絡分析。

運用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 20）中ANOVA統(tǒng)計目的基因在不同類型肌肉之間的表達差異。所有數據以Mean ± SE表示，＜0.05，表示差異顯著；＜0.01，表示差異極顯著。

2 結果

2.1 清遠麻雞比目魚肌和趾長伸肌中肌纖維性狀比較

比較了清遠麻雞比目魚肌和趾長伸肌的肌纖維橫截面積、直徑、密度以及氧化型和酵解型肌纖維的比例，結果見表2?？梢?，趾長伸肌的肌纖維橫截面積、直徑以及酵解型纖維比例均顯著高于比目魚肌（＜0.05），而肌纖維密度和氧化型纖維比例則顯著低于比目魚肌（＜0.05）。

表2 清遠麻雞比目魚肌和趾長伸肌的肌纖維性狀比較

1Significance: * (＜0.05)

2.2 比目魚肌和趾長伸肌中差異表達基因篩選及熒光定量PCR驗證

采用Agilent雞全基因組表達譜芯片比較清遠麻雞比目魚肌和趾長伸肌中基因表達譜差異，共發(fā)現差異倍數在2倍及以上的基因1 224個（＜0.05, FC≥2），以趾長伸肌作為參照，比目魚肌中上調基因為654個，下調基因為570個，差異基因的功能主要涉及收縮結構和細胞骨架、細胞信號、能量代謝、應激、轉錄調控、脂肪酸合成和代謝等方面。所有芯片數據均已提交至NCBI的GEO數據庫（登錄號為GSE69918）。

采用熒光定量PCR的方法對基因芯片所篩選的差異表達基因進行了驗證，隨機選取9個基因，其中下調基因6個（MYH1E, PPP3CA, PPP3R1, PRKAG3, FASN和STAT5B），上調基因2個（PPARGC1A, BMP4和SCD5）。除了FASN基因外，其他8個基因在兩種肌肉組織中的表達量均表現出顯著差異（＜0.05 or＜0.01）（圖1）。通過相關分析發(fā)現，芯片和熒光定量PCR兩種方法所得的結果具有正相關關系，所選基因的表達趨勢是一致的，Pearson相關系數為0.85（表3），結果進一步驗證了芯片結果的可靠性。

2.3 差異表達基因的GO和KEGG信號通路分析

對差異表達基因進行GO（GO ontology）功能分類，共發(fā)現了74個顯著性GO（＜0.05），主要分為3大類：生物學過程（34個顯著性GO）、分子功能（20個顯著性GO）和細胞組分（20個顯著性GO）。在生物學過程方面，發(fā)現差異表達基因主要參與了能量代謝過程（包括小分子代謝過程，碳水化合物代謝過程，糖酵解過程，氧化還原過程，類固醇代謝過程以及丙酮酸代謝過程）。同時，3個與肌肉發(fā)育相關的生物學過程也被顯著富集，分別為快肌與慢肌纖維的轉換過程，胚胎骨骼形態(tài)發(fā)生過程以及骨骼肌收縮過程，TNNC1, ATP2A2, HOXD11, COL2A1, CHRNA1和TNNI2等6個基因參與了這些生物學過程，這些基因可能在肌纖維發(fā)育和類型組成中發(fā)揮重要作用。

本研究的差異表達基因共被富集到20條顯著的KEGG信號通路（＜0.05），其中心肌細胞的腎上腺素信號通路最為顯著（圖2）。值得關注的是，一些已知的與肌纖維類型轉換（Calcium和PPAR信號通路）、肌肉發(fā)育（Insulin信號通路）以及脂質代謝（adipocytokine信號通路）相關的信號通路也在兩種類型的肌肉中被富集到，共有62個差異表達基因參與到這4條信號通路中，包括ATP2A2, PRKAG3, PPARGC1A和TNNC1。

表3 芯片和熒光定量兩種方法基因表達的差異倍數

*表示達到顯著水平P＜0.05，**表示達到極顯著水平P＜0.01 * shows significance level at P＜0.05,** shows significance level at P＜0.01.

圖2 兩種類型肌肉組織中差異表達基因富集顯著的KEGG信號通路

2.4 差異基因共表達調控網絡分析

為了進一步了解差異表達基因之間的調控網絡關系，筆者從差異表達的基因中選擇了一些已知的與肌纖維生長發(fā)育和類型組成相關的基因，首先采用Person’s相關分析基因間的相關系數，然后以相關系數2＞0.8且＜0.05為篩選標準，選留了300個基因對，并采用cytoscape3.3軟件構建基因共表達網絡。結果顯示，PPP2CA, PRKAG3, ATP2A2, PPARGC1A和PPARGC1B為關鍵節(jié)點基因（圖3）。

綜合GO，KEGG信號通路以及基因共表達網絡分析結果，推測PRKAG3, ATP2A2 以及PPARGC1A可能是與肌纖維類型性狀緊密關聯(lián)的關鍵基因，且ATP2A2和PPARGC1A在紅肌中的mRNA表達水平要高于白肌。因此，筆者選擇了其中的PPARGC1A基因進行了后續(xù)的功能驗證。

紅色表示上調基因，綠色表示下調基因，色塊的大小表示上調或下調的倍數多少，實線和虛線分別表示正相關和負相關

2.5 干擾PPARGC1A基因后對肌纖維發(fā)育及類型相關基因的影響

本研究設計的4對shRNA片段（shRNA-563, shRNA-926, shRNA-1317和shRNA-1688）的干擾效率分別為11%，26%，46%和37%。因此，選擇干擾效率最高的shRNA-1317進行正式試驗。在干擾后96h，熒光定量PCR結果顯示，PPARGC1A基因的表達被有效抑制（＜0.01）。PPARGC1A基因的敲低，也引起了PPP3CA（＜0.01），MEF2C（＜0.05）以及SM（＜0.01）等慢肌纖維標志基因以及與肌纖維發(fā)育與轉換相關基因表達水平的顯著降低，而快肌纖維標志基因FWM的表達水平則顯著上升（＜0.05）（圖4）。

**和*分別表示P＜0.01和P＜ 0.05 ** and * indicated P＜0.01 and P＜0.05, respectively

3 討論

3.1 兩種類型肌肉之間的差異表達基因分析

肌纖維類型的組成可影響肉色、系水力、嫩度、多汁性以及風味等諸多肉品質性狀。RENAND等研究表明，肌纖維大小與肉品質性狀存在負相關，I型肌纖維含量越高的肌肉，其多汁性和風味越好[15]。本研究發(fā)現，清遠麻雞比目魚肌和趾長伸肌在表型上也存在顯著的差異，趾長伸肌中肌纖維橫截面積、直徑以及白肌纖維的比例均顯著高于比目魚肌，這也與前人報道的比目魚肌為紅肌為主的肌肉，而趾長伸肌為白肌為主的肌肉的事實相符合[4]。因此，本研究以這兩種類型肌肉為研究對象，采用安捷倫雞全基因組表達譜芯片挖掘雞肌纖維生長發(fā)育及類型組成的候選基因。結果在比目魚肌和趾長伸肌間共發(fā)現了1 224個差異表達基因，隨機選取其中9個差異表達基因進行熒光定量PCR驗證，盡管所選基因在兩種方法間的差異倍數并不完全一致，但表達趨勢是高度一致的，這也證明本研究芯片分析得出的結果是可信的。

通過對差異表達基因的分析和文獻檢索，發(fā)現一些已被報道的在紅肌和白肌間差異表達的基因，如PGM1, fibronectin, HMOX1, SM1, MYH1E, PPARGC1A, PPARGC1B, PPP3CA以及PPP3R1[8, 10, 16-18]，在本研究中同樣被篩選到。值得關注的是，一些能量代謝相關酶基因、膠原蛋白基因以及慢肌蛋白編碼基因等可能與優(yōu)良肉品質相關的基因在氧化型肌肉中的表達量也要顯著高于酵解型肌肉。同時，本研究也發(fā)現了一些未曾報道的與肌纖維類型相關的重要轉錄因子如PPARA, HOXA1以及GTF3C6等，在不同類型的肌肉間也表現出顯著的差異表達，這些將可能作為對不同肌纖維類型進行調控的新轉錄因子進行進一步研究。

3.2 GO、KEGG信號通路及共表達網絡分析

本研究的GO功能分類結果發(fā)現，參與能量代謝相關通路（如小分子代謝過程、碳水化合物代謝過程、糖酵解過程、氧化還原過程、類固醇代謝過程和丙酮酸的代謝過程）和肌肉發(fā)育相關通路（如快肌與慢肌纖維的轉換過程，胚胎骨骼形態(tài)發(fā)生過程以及骨骼肌收縮過程）的基因在兩種類型的肌肉中具有顯著差異，這也與不同肌纖維類型具有不同的能量代謝特征的報道一致[19]。KEGG信號通路分析發(fā)現，心肌細胞的腎上腺素信號通路被富集為最顯著的通路，該信號通路是心肌細胞中最為重要的蛋白信號系統(tǒng)，能夠調節(jié)心臟搏動時間、鈣離子轉運以及收縮強度[22]。同時，一些與肌纖維類型轉換相關的通路（如Calcium和 PPAR信號通路）、肌肉發(fā)育相關通路（Insulin信號通路）以及脂質代謝相關通路（如adipocytokine信號通路）也被富集為顯著的信號通路。Calcium信號通路是迄今發(fā)現的唯一受鈣離子/鈣調素（Calmodulin, CaM）活化的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可通過去磷酸化作用使某些特異的轉錄因子如T細胞活化核因子（nuclear factor of activated t cell, NFAT）和核因子kappaB（Nuclear factor kappa B, NFКB）等激活后進入細胞核，對基因轉錄進行調控，可促使慢肌纖維特異表達的一些基因表達水平上調[23]。PPAR信號通路在肌纖維類型的調控中同樣發(fā)揮著重要的作用[24]。Insulin信號通路中的IGF-I很早即被證明能夠刺激成肌細胞分化速率并影響生肌調節(jié)因子家族基因的表達[25-26]。該結果表明與肌肉、脂肪和結締組織發(fā)育相關的信號通路之間可能存在互作，形成了一個復雜的調控網絡從而影響肌纖維發(fā)育和類型組成。

本研究進一步基于GO和KEGG信號通路分析中發(fā)現的或者已有文獻報道的與肌纖維發(fā)育和類型轉換相關的基因，進行了基因共表達網絡分析。通過共表達網絡分析發(fā)現了3個可能與雞肌纖維類型組成相關的重要的節(jié)點基因（PRKAG3, ATP2A2 和PPARGC1A），這3個基因彼此之間存在互作關系，這與前人的報道相一致[27]。PRKAG3是編碼一磷酸腺苷激活蛋白激酶（a heterotrimeric serine/threonine protein kinase，AMPK）γ3亞基的基因，只在骨骼肌中特異性地表達。CHEN等報道PRKAG3基因中的一個SNP位點對肌纖維密度具有顯著的遺傳效應[28]。本研究中，PRKAG3基因在趾長伸肌中的mRNA表達量要顯著高于比目魚肌（差異倍數為10.82，＜0.01），這也與趾長伸肌中具有較高的糖原含量的事實相符合，同時也與前人在哺乳動物中的報道結果一致，即PRKAG3基因在快速酵解型肌肉中的表達量要顯著高于氧化酵解型肌肉，而在慢速氧化型肌肉中基本檢測不到[29]。ATP2A2是ATP2As基因家族的成員，編碼肌漿（內質）網鈣轉運ATP酶中的一種，即SERCA2，在鈣離子相關信號通路中發(fā)揮著重要作用。WEI等報道ATP2A2能夠調控慢肌基因的表達[30]，這也與本研究中該基因在氧化型的比目魚肌中特異性高表達（差異倍數151.9，＜0.001）的結果一致。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1A（PPARGC1A或PGC-1α）是一種多功能的輔激活因子，在骨骼肌超表達PGC-1α的轉基因小鼠中，快酵解型肌肉股肌和跖肌中I型肌纖維的含量增加；同時，利用快慢肌纖維特異的啟動子，發(fā)現PGC-1α與MEF2蛋白協(xié)同激活慢肌纖維相關基因的轉錄并能夠作為CaN信號通路的靶基因發(fā)揮作用[16]。課題組前期研究了PGC-1α基因對雞肌纖維特性的遺傳效應，發(fā)現該基因的多態(tài)位點及其單倍型與肌纖維類型等性狀緊密關聯(lián)[31]，因此，本研究選擇PPARGC1A基因作為影響肌纖維類型組成及轉換的候選基因進行了進一步的功能研究。

3.3 PPARGC1A基因在肌纖維類型組成和轉換中的作用

本研究共構建了4對shRNA片段來研究PPARGC1A基因在肌纖維類型組成和轉化中的功能，通過預試驗選擇了干擾效率最高的shRNA-1317進行正式試驗。結果發(fā)現，PPARGC1A基因的敲低，引起了PPP3CA，MEF2C以及SM等慢肌纖維標志基因以及與肌纖維發(fā)育與轉換相關基因表達水平的顯著降低，而快肌纖維標志基因FWM的表達水平則顯著上升，這一結果也證明了PPARGC1A基因能夠與鈣離子信號通路相關基因協(xié)同從而在雞肌纖維類型組成和轉換中發(fā)揮著重要作用，也驗證了LIN等的結論，即PPARGC1A可能與MEF2蛋白協(xié)同激活慢肌纖維相關基因的轉錄并能夠作為CaN信號通路的靶基因發(fā)揮作用[16]。

4 結論

首次在全基因組水平上研究了清遠麻雞不同類型肌肉（紅肌和白?。┲谢虮磉_差異，發(fā)現了PRKAG3, ATP2A2和PPARGC1A基因可能在肌纖維類型組成和轉換中發(fā)揮重要作用。對PPARGC1A基因進一步的功能驗證證實了該基因在雞肌纖維類型組成和轉換中發(fā)揮了重要的作用。本研究結果將對中國地方雞肉品質性狀的遺傳改良提供重要的理論指導。

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（責任編輯 林鑒非）

Analysis of Differential Expression Genes Between Different Myofiber Types in Chicken Skeletal Muscle Based on Gene Expression Microarray

SHU JingTing, JI GaiGe, SHAN YanJu, ZHANG Ming, XIAO Qin, TU YunJie, SHENG ZhongWei, ZHANG Di, ZOU JianMin

(Jiangsu Institute of Poultry Science，Key laboratory for Poultry Genetics and Breeding of Jiangsu Province, Yangzhou 225125)

【Objective】It has been well documented that myofiber type composition can profoundly influence postnatal muscle growth and meat quality, a higher content of red (oxidative) fibers in muscles exhibits excellent meat quality than muscles contain a high content of white (glycolic) fibers. However, the molecular processes that govern the expression of specific fiber type and the phenotypic characteristics of skeletal muscle remains unclear. In the present study, the transcriptional differential analysis between red and white myofiber types was firstly studied in Qingyuan partridge chickens in order to identify key factors that regulates chicken myofiber composition and transition. 【Method】A global gene expression profiling investigation was conducted to identify differentially expressed genes between red () and white () muscle of Qingyuan partridge chickens using the Agilent Chicken Gene Expression Chip. qRT-PCR assays were used to validate the microarray hybridization results, and lentivirural plasmids pack-aging system was used to establish a lentiviral vector for RNA interference of specific targeting chicken PPARGC1A gene to study the function of the target gene. 【Result】A total of 1224 genes with at least 2-fold differences were identified at the<0.05 significance level (<0.05, FC ≥ 2). Compared with the expression of transcripts in EDL, a set of 654 transcripts belonged to the up-regulated group, and another set of 570 transcripts belonged to the down-regulated group in SOL. Although fold changes of the selected genes were not exactly the same between real-time PCR assay and microarray assay, the expression tendencies were highly consistent, suggesting that the data from microarray assay in this study was reliable. A total of 74 significantly different GO terms (value<0.05) were obtained. These terms were categorized into one of three categories: biological process, molecular function and cellular component. KEGG pathway analysis revealed that some well known pathways affecting muscle fiber transition, muscle development and lipid metabolism were enriched in both types of muscles. The results of the GO, KEGG pathway and gene coexpression network analysis indicated that PRKAG3, ATP2A2 and PPARGC1A might be the key genes related to chicken muscle fiber characteristics, and PPARGC1A was selected for the further functional analysis. Genes involved in the calcium signaling such as PPP3CA and MEF2C as well as MyHC SM isoform were significantly down-regulated, while MyHC FRM isoform was significantly up-regulated by PPARGC1A knockdown after shRNA interference.【Conclusion】The analysis presented the gene expression profiles and identified DEGs that may be related to the phenotypic differences between red (SOL) and white (EDL) muscles in chickens. Further shRNA analysis demonstrated that PPARGC1A might play an important role in chicken myofiber composition and can co-activate the transcriptional activity of calcium signaling genes. Results of this study will provide new clues to understand the molecular basis of chicken myofiber composition and transition, and also will provide a theoretical basis for improving and controlling meat quality of chickens.

microarray;differential transcriptional analysis; myofiber types; PPARGC1A; chicken

2016-07-25；接受日期：2017-05-22

國家自然科學基金（31301967，31572358）、現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-42-G03）、江蘇省重點研發(fā)計劃（現代農業(yè)）（BE2015344）、江蘇省農業(yè)自主創(chuàng)新資金（CX(15)1009）、江蘇省自然科學基金（BK20161322）、江蘇現代農業(yè)（肉雞）產業(yè)技術體系集成創(chuàng)新中心（首席專家）（SXGC[2017]254）

束婧婷，E-mail：shujingting@163.com。通信作者鄒劍敏，E-mail：jqszjm@163.com