家蠶堿性磷酸酶原核表達純化、結構與活性分析

何華偉，王葉菁，侯麗，李瑜，位曙光，趙朋，蔣文超，趙萍

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家蠶堿性磷酸酶原核表達純化、結構與活性分析

何華偉1,2,3，王葉菁2，侯麗2，李瑜1，位曙光1，趙朋1，蔣文超1，趙萍1

（1西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400715；2西南大學生物技術學院，重慶 400715；3西南大學重慶市蠶絲纖維新材料工程技術研究中心，重慶 400715）

【目的】堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是生物體內磷酸代謝的關鍵調控酶。不同物種ALP的性質與其生理功能密切相關。研究家蠶（）ALP(BmALP)的性質和結構，為揭示ALP在昆蟲體內的生理功能和調控機制提供依據。【方法】取5齡3 d家蠶中腸組織，利用Trizol法提取總RNA，然后以其為模板反轉錄合成cDNA。以家蠶中腸cDNA為模板，利用Primer Premier 6.0軟件分別設計上下游引物，通過PCR克隆。將與不同的表達載體分別進行雙酶切，然后連接并轉化表達菌株，利用大腸桿菌表達重組蛋白。比較不同表達載體在上清中的表達情況，選擇可溶性重組蛋白表達最好的載體，利用Origami B (DE3)細胞大量表達重組蛋白，借助Ni-NTA親和層析純化重組的His-Trx-BmALP蛋白，然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h，再次利用Ni-NTA親和層析去除融合標簽His-Trx。利用凝膠過濾層析分析BmALP分子量及其在溶液中的狀態，利用圓二色光譜研究BmALP的二級結構及其隨溫度的變化。通過酶活分析研究BmALP的最適pH、最適溫度、Km、結構穩定性及金屬離子對其酶學活性的影響。【結果】從家蠶中腸組織提取了總RNA，反轉錄合成了cDNA，并以該cDNA為模板成功克隆了。分別構建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3種表達載體。表達分析發現，pET32M.3C載體有助于重組的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在細胞裂解后的上清液中表達，然后利用pET32M.3C載體大量表達重組蛋白，并通過Ni-NTA親和層析純化獲得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切，再次通過Ni-NTA親和層析去除了融合標簽His-Trx。凝膠過濾分析顯示BmALP在溶液中形成穩定的二聚體結構。圓二色光譜研究表明BmALP包含有-螺旋結構，其含量隨溫度的升高逐漸減少。酶活分析揭示BmALP的最適pH和最適溫度分別為 11.0和45℃。測定BmALP的Km值為1.40 mmol·L-1。在10℃處理2 h后，BmALP的殘余活性最高；35℃處理2 h后，其活性完全喪失。Mg2+和Zn2+促進了BmALP催化反應的進行，其最適濃度分別為40和5 mmol·L-1。在20 mmol·L-1濃度范圍內，Cu2+激活了BmALP活性，其中10 mmol·L-1時激活效果最好，濃度超過20 mmol·L-1時，Cu2+則抑制了BmALP活性。【結論】克隆了家蠶堿性磷酸酶基因，表達純化了BmALP蛋白并分析了其結構和性質，為深入研究其結構和功能打下了基礎。

家蠶；堿性磷酸酶；表達純化；結構；性質

0 引言

【研究意義】堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP，EC 3.1.3.1）是動植物和微生物體內廣泛存在的一類高度保守的磷酸水解酶。它催化磷酸單酯的水解，生成無機磷酸和相應的產物，還可以催化磷酸基團在不同底物間的轉移，因此在生物體內對磷酸基團的轉移和代謝發揮著重要的調控作用。昆蟲ALP與昆蟲發育、神經傳導、激素合成、物質代謝、滯育和社會型昆蟲亞種形成等方面密切相關，在農林害蟲生物防控領域具有重要的研究價值和應用前景。家蠶（）是重要的經濟昆蟲，同時也是鱗翅目昆蟲研究的模式物種。研究家蠶ALP的結構和性質，有助于更好地理解ALP對昆蟲代謝調控的分子機制，并為害蟲的生物防控和資源昆蟲飼養提供借鑒。【前人研究進展】早在20世紀40年代，Nakamura[1]就利用組織化學的方法在家蠶中腸鑒定了ALP。隨后，相繼在黑腹果蠅（）、沙漠蝗（）和黑小按蚊（）體內鑒定了ALP的同工酶[2]。隨著研究的深入，不同組織來源的ALP同工酶分別在鱗翅目、同翅目、雙翅目、膜翅目和直翅目等昆蟲中被發現。在美洲大蠊（）的頭部發現了兩種ALP同工酶，可能參與了神經傳導[3]。黑腹果蠅ALP位于頭部的神經元中，可能調控了細胞內鈣離子跨膜運輸和神經細胞的分化和增殖[4]。煙粉虱（）ALP存在于唾液腺中，幫助分泌膠狀唾液以形成唾液鞘，還能通過導管分泌到唾液中，參與食物的體外消化[5]。家蠶ALP最早發現于中腸，可能參與了腸道壁膜上葡萄糖和脂肪酸的運輸[6]。家蠶中腸中至少存在兩種ALP同工酶：一種是與膜結合的ALP（m-ALP），通過GPI錨定在膜上參與營養物質的消化吸收；一種是可溶性ALP（s-ALP），位于杯狀細胞內腔，參與離子平衡調控[7-14]。此外，在銅綠蠅（）、金色果蠅（）、印度竹節蟲（）和西方蜜蜂（）的腸道上皮細胞也鑒定到了ALP，可能與糖原和油脂吸收相關[15-19]。科羅拉多馬鈴薯甲蟲（）中腸m-ALP和s-ALP的活性與取食和滯育有關[20]。煙草天蛾（）和煙芽夜蛾（）腸道中的ALP可能與（Bt）毒劑抗性有關[21-22]。除此之外，ALP還廣泛存在于昆蟲馬氏管、表皮和血淋巴、脂肪體、生殖系統、附肢等不同的組織中，甚至在家蠶的絲腺、美洲大蠊的胃液和螞蟻的毒液中也發現了ALP[23-25]。哺乳動物的ALP一般由兩個相似或相同的亞基組成二聚體[26]，而家蠶、煙草天蛾、蝗蟲和埃及伊蚊（）ALP均為單亞基[13,21,27-28]。ALP是一種金屬酶，其構象和酶活維持需要鎂離子和鋅離子的存在。EDTA可以顯著地抑制家蠶中腸ALP酶活性，而鎂離子和鋅離子可以幫助其部分恢復活性[29]。重金屬離子Cd2+、Pb2+和脲強烈地抑制白蠟蟲（）ALP的酶活，同樣Zn2+和Cu2+也表現為抑制作用，而Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+和Ni2+則對該酶表現出激活效應[30]。絲氨酸、賴氨酸、色氨酸和部分二硫鍵可能是白蠟蟲ALP維持其催化活性的必需功能基團[31]。家蠶中腸m-ALP和s-ALP的最適pH分別為10.9和9.8，與其腸道消化液的生理環境基本一致[13]。m-ALP在pH 10.0—12.0之間非常穩定且具有較高活性，可以抵抗消化液中蛋白酶的作用而s-ALP則不能[8-9]，暗示了m-ALP可能在家蠶中腸內腔發揮作用。煙粉虱唾液ALP的最適pH為10.4，在植物韌皮部汁液（pH約7.0）仍然具有活性[5]。煙粉虱和溫室白粉虱（）不同發育時期體內ALP最適pH均為7.8[32]。沙漠蝗中腸和附肢ALP最適pH分別為7.4和6.5[27,33]，表明同種昆蟲不同部位的ALP性質可能并不相同。沙漠蝗、蚊和煙粉虱ALP的最適溫度分別為40、37和47℃[32-34]，表明不同昆蟲ALP在體內的活性存在一定的差異。果蠅ALP酶活對熱較敏感[35]，煙粉虱唾液ALP在pH 6.5時對熱穩定，在最適pH附近其活性很快喪失[5]。不同蟲態煙粉虱和白粉虱的ALP最適溫度均為47℃，但在27—67℃范圍內煙粉虱ALP比白粉虱ALP活性更穩定，二者熱穩定性的差異可能反映了其競爭力的不同[32]。對于同一昆蟲，不同ALP同工酶的熱穩定性也不相同，如地中海實蠅（）ALP1和ALP2，前者要比后者有更好的熱穩定性[36]。【本研究切入點】ALP活性可以反映家蠶的生理狀況和經濟價值[37]。增加ALP活性可以提高晚秋季節蠶繭的質量[38]。家蠶中腸內已經鑒定發現m-ALP和s-ALP兩種同工酶[12-13]，隨后發現m-ALP基因具有多態性，s-ALP可以轉錄成2.0和2.4 kb兩種mRNA[39]。m-ALP和s-ALP基因結構高度保守，二者順序定位于基因組一小段區域，推測可能起源于一個共同的基因[40]。李長春等[41]從家蠶腸液純化獲得一種等電點為4.7的ALP同工酶，該酶不同于之前鑒定的m-ALP和s-ALP，表明ALP同工酶之間性質存在一定的差異。筆者實驗室從家蠶基因組數據庫中檢索到一個家蠶中腸高量表達的ALP，基因編號為BGIBMGA041304，將其命名為，其序列與其他已知的ALP序列高度保守，然而目前對該蛋白的結構和性質了解甚少。研究ALP同工酶的結構和性質，有助于更好地揭示ALP對家蠶生命活動調控的分子機理。【擬解決的關鍵問題】從家蠶中腸克隆，構建原核表達載體，表達純化獲得BmALP蛋白，研究其結構和酶學性質，從而為深入揭示其生理功能打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2014年5月至2016年5月在西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室完成。

1.1 材料和試劑

試驗所用家蠶品種為大造，PCR模板為5齡3 d家蠶中腸組織cDNA，均由西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室提供。美國西南醫學中心張學武教授饋贈表達載體pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C[42]。DH5和Origami B (DE3)細胞分別購自北京全式金生物技術有限公司和北京天恩澤基因科技有限公司。H I、d III和T4 DNA連接酶購自New England Biolabs和TaKaRa公司。其他分子生物學試劑盒和試劑等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 生物信息學分析

通過比對分析家蠶基因組數據庫SilkDB（http:// www.silkdb.org/）和PubMed（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/）獲取染色體定位、基因結構和cDNA序列，利用在線工具Protparam （http://web. expasy.org/protparam/）分析BmALP蛋白基本性質包括氨基酸組成、分子量、等電點和疏水性等信息，預測其二級結構和三級結構。分別利用PrediSi （http://www.predisi.de/）和SMART （http://smart. embl-heidelberg.de/）預測信號肽和結構域。通過PubMed進行同源序列比對分析，利用Mega[43]構建蛋白同源比對分子進化樹。

1.3 表達載體構建

根據預測，5′末端存在一段51 bp編碼信號肽的堿基序列。不考慮編碼信號肽的DNA堿基，根據其cDNA序列，分別設計了正反向引物：5′-CGCGTCGATATGGATTAGATAAGGA-3′和5′-CCTTAAGTAGTTGAATGTGGTGAATG-3′，其中下劃線部分分別表示H I和d III酶切位點。以5齡3 d家蠶中腸組織cDNA為模板，通過PCR擴增獲得基因編碼序列，進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將該片段切膠回收后分別與pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C載體同時進行H I和d III雙酶切，然后利用T4 DNA連接酶將連接到上述不同的載體上。將所得連接產物分別轉化DH5感受態細胞，隨后分別通過菌落PCR、雙酶切和基因測序驗證獲得構建正確的重組質粒。

1.4 蛋白表達分析

蛋白表達純化借鑒文獻[42,44-45]。分別將3種正確構建的重組質粒轉化Origami B (DE3)細胞，挑取單克隆在37℃培養過夜，然后在含有抗生素的LB培養基中擴大培養至OD600約0.6—1.0，加入0.1 mmol·L-1IPTG分別在16℃和37℃下培養20 h和4 h以誘導重組蛋白表達。離心收集細胞，加入預冷的緩沖溶液A（20 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，500 mmol·L-1NaCl，5% Glycerol）充分懸浮細胞，冰浴超聲破碎細胞，然后于4℃下12 000 r/min離心20 min，分別收集細胞裂解后的上清和沉淀，最后通過12.5% SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色分析不同培養條件下3種重組蛋白的表達情況。

1.5 重組蛋白純化

發現重組的His-Trx-BmALP在16℃下在上清中表達量較高，故選擇His-Trx-BmALP重組載體在16℃下進行大量表達純化。在16℃、200 r/min轉速下，加入0.1 mmol·L-1IPTG繼續培養20 h，收集細胞，破碎后于4℃以12 000 r/min離心20 min收集上清，經0.45 μm濾膜過濾后在4℃下與Ni-NTA填料結合，然后利用不同濃度的咪唑進行梯度洗脫，收集洗脫液進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色分析。收集較純的蛋白組分，濃縮后利用HiPrep 26/10脫鹽柱除去咪唑，同時置換為緩沖液B（50 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，150 mmol·L-1NaCl，5%甘油），加入Prescission蛋白酶在4℃酶切12 h，將酶切產物再次流經Ni-NTA親和層析柱，利用咪唑梯度洗脫，取少量洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測，然后根據SDS-PAGE結果，收集較純電泳條帶相對應的洗脫下來的BmALP蛋白，脫鹽后濃縮，于-80℃凍存。

1.6 凝膠過濾分析

將BmALP蛋白解凍后于4℃、12 000 r/min離心20 min以去除不溶物，取0.5 ml上清載入Superdex 200 10/300 GL凝膠層析柱進行凝膠過濾分析，流速為0.5 ml·min-1，平衡緩沖液C為20 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，150 mmol·L-1NaCl，5%甘油。收集蛋白組分，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.7 二級結構分析

借助超濾濃縮離心管將BmALP蛋白置換于磷酸緩沖液PBS中，然后在圓二色光譜儀MOS-500（法國）上對BmALP蛋白在溶液中的二級結構進行分析。試驗在25℃下進行，波長范圍為190—250 nm，比色皿光程1 cm，蛋白濃度為0.1 mg·mL-1，掃描速度為240 nm·min-1。在5—80℃范圍內逐漸升高溫度，記錄BmALP蛋白的圓二色光譜。以222 nm處的橢圓度值θ222表征BmALP蛋白的螺旋結構，然后對溫度作圖，分析溫度對BmALP蛋白螺旋結構的影響。

1.8 酶活性分析

BmALP的酶活檢測參考WANG等[46]。測活體系包括：10 mmol·L-1對硝基苯磷酸二鈉（-nitrophenyl phosphate，NPP），5 mmol·L-1MgCl2，Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，pH 11.0，4 μL BmALP，反應總體積為200 μL。反應溶液現配現用，避光保存。將反應溶液在30℃孵育10 min后加入1 mL 1 mol·L-1NaOH終止反應，在紫外分光光度計上記錄生成的產物在405 nm處吸光值。以緩沖液為對照，所有試驗重復3次，取平均值計算BmALP的活性。

1.9 酶學性質分析

將BmALP的酶活反應體系分別設定為pH 3.0、4.0、5.0、6.2、7.2、8.2、9.2、10.0、10.2、10.4、10.6、11.0、12.0、13.0和13.7的緩沖溶液，其他保持不變，然后按照上述方法檢測BmALP活性，從而確定BmALP酶活的最適反應pH。

將BmALP的酶活反應體系分別在4、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60和65℃下孵育10 min，然后按照上述方法檢測BmALP活性以確定其酶活最適反應溫度。

以NPP為底物，在最適反應pH和最適反應溫度下測定BmALP催化的反應速度，利用雙倒數作圖法計算BmALP的米氏常數Km，NPP的濃度范圍為0.2—5.0 mmol·L-1。

將BmALP分別在4、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65和70℃下孵育2 h，然后按照上述方法檢測BmALP活性以分析其熱穩定性。

向反應體系中分別加入不同終濃度的MgCl2、ZnCl2和CuCl2，然后按照上述方法檢測BmALP 活性以分析不同的金屬離子對BmALP活性的影響。

2 結果

2.1(型)克隆與分析

根據SilkDB和PubMed數據庫，以5齡3 d家蠶中腸組織cDNA為模板進行PCR擴增，獲得長度約為1 536 bp的序列。將獲得的片段分別與pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C載體連接，轉化DH5，然后依次進行菌落PCR、雙酶切和基因測序驗證，最終成功構建了3個重組質粒載體。圖1-A分別顯示了克隆、pET32M.3C載體構建成功后的菌落PCR和雙酶切驗證過程的電泳檢測圖。

A：BmALP PCR擴增、菌落PCR和雙酶切驗證1% agarose gel analysis of BmALP. M: DNA marker; 1: PCR product; 2: Colony PCR product; 3: Double enzyme digestion products；B：BmALP基因組序列分析The analysis of BmALP complete genomic sequence。ATG：起始密碼子Start codon；TGA：終止密碼子Stop codon；水平線的長度表示基因組序列的長度The length of horizontal line represented the length of genomic sequence；黑色區塊表示不同長度的外顯子the black blocks represented different length exons

在PubMed中的登錄號為692396，該基因定位于家蠶第3號染色體，為多外顯子基因，基因全長7 652 bp，其中包括5個外顯子和4個內含子（圖1-B）。mRNA由1 587 bp組成，編碼528個氨基酸殘基，蛋白分子量為57.48 kD，等電點為5.55。

2.2 BmALP蛋白分析

信號肽預測發現BmALP蛋白N末端第1—17位氨基酸為信號肽，因此在引物設計時未予考慮。成熟的BmALP蛋白包含511個氨基酸殘基，分子量為55.78 kD，等電點為5.51。BmALP蛋白由20種氨基酸組成，包含8個半胱氨酸和28個組氨酸殘基，含量分別為1.5%和5.3%。N末端信號肽部分由帶正電荷的氨基酸殘基組成，N末端其余部分和C末端由帶負電荷的氨基酸殘基組成，中間部分由帶正電荷和負電荷的殘基交互組成（圖2-A）。SMART分析發現BmALP蛋白主要由1個堿性磷酸酶結構域（75—514位氨基酸殘基）組成，其中N末端1—17位氨基酸殘基為信號肽，與預測一致（圖2-B）。PubMed分析表明BmALP屬于類堿性磷酸酶超家族一員，其中第83、132—133、196、198、209、355、360—361、364、401—402、477位氨基酸殘基是決定酶活性的關鍵位點，第87—88、91、94—95、113、116、118—120、122、124、126、130、143—145、155、172、405、407—410、432—433、438—439、476、478—481、483、496—499、501—502、505位氨基酸殘基作為同源二聚體的相互作用位點參與了BmALP同源二聚體的形成（圖2-C）。

A：氨基酸組成分析Amino acid composition analysis；B：結構域預測Domain prediction；C：保守結構域和關鍵氨基酸位點分析Analysis of conserved domain and key residues；D：預測BmALP蛋白二級結構Prediction of BmALP secondary structures；E：預測BmALP蛋白三級結構Prediction of the tertiary structure of BmALP

二級結構和三級結構分析顯示BmALP蛋白由2個顯著部分組成，其中N末端由兩段螺旋結構和長長的柔性無規則結構組成，其余部分組成一個致密的完整結構域，主要由多段螺旋包裹一些短的片層結構組成（圖2-D、2-E）。

2.3 BmALP蛋白同源比對

以BmALP氨基酸序列為模板進行BLAST分析，然后構建蛋白同源比對分子進化樹，結果如圖3所示。氨基酸同源比對分析顯示，家蠶BmALP與同為鱗翅目的柑橘鳳蝶（）、草地夜蛾（）的堿性磷酸酶序列相似度最高，暗示了這些物種的堿性磷酸酶可能具有共同的進化起源。序列相似性差異最大的是斑馬魚（）、小鼠（）和智人（）的堿性磷酸酶，顯示了堿性磷酸酶進化過程中在不同物種間的差異。

圖3 BmALP與其他物種同源蛋白的比對分析

2.4 BmALP蛋白表達純化

將分別與pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C載體連接（圖4-A），然后轉化Origami B (DE3)細胞，在16℃和37℃下，加入0.1 mmol·L-1IPTG分別誘導重組蛋白的表達。SDS-PAGE電泳分析顯示，利用pSKB2-BmALP載體，在16℃下，無論是細胞裂解后的上清液還是沉淀中都沒有觀察到目的蛋白His-BmALP的條帶（圖4-B，泳道3和4）；利用pET32M.3C-BmALP載體，在16℃的上清和沉淀中都觀察到了目的蛋白His-Trx-BmALP條帶的出現（圖4-B，泳道5和6）；ppSUMO載體同樣可以促進BmALP的表達，在16℃和37℃誘導下，在細胞裂解后的上清液和包涵體中都能觀察到目的蛋白His-Sumo-BmALP條帶（圖4-B，泳道7—10）。與37℃相比，在16℃下，可溶性的His-Sumo-BmALP表達量更高，包涵體表達量不如37℃明顯，表明在37℃下，His-Sumo-BmALP更容易表達形成包涵體出現在沉淀中。比較發現pET32M.3C-BmALP載體更好地促進了His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式出現在細胞裂解后的上清液中，因此選擇在16℃下，利用pET32M.3C-BmALP重組載體來大規模表達純化BmALP。

在16℃下，加入0.1 mmol·L-1IPTG大規模誘導重組His-Trx-BmALP蛋白的表達，然后在4℃利用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白。SDS-PAGE電泳分析顯示，250 mmol·L-1咪唑洗脫的目的蛋白純度超過了90%（圖5-A）。收集250 mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫組分，脫鹽除去咪唑后，加入Prescission蛋白酶在4℃酶切過夜，再次利用Ni-NTA親和層析純化去除標簽后的BmALP蛋白。結果顯示，大約90%的His-Trx-BmALP蛋白可以被Prescission蛋白酶切開（圖5-B泳道2）。利用緩沖溶液、10和20 mmol·L-1咪唑洗脫可以獲得純度超過95%的BmALP蛋白（圖5-B泳道4—6）。收集泳道4—6對應的蛋白組分，脫鹽后濃縮，凍存于-80℃。

A：BmALP重組載體構建示意圖The diagram of the construction of BmALP；B：BmALP蛋白表達分析Analysis of BmALP expression。M：蛋白分子量標準protein molecular weight marker；1、2：空載質粒37℃下細胞裂解后上清液和沉淀the supernatant and pellet of cell lysate without exogenous plasmid at 37℃；3、4：pSKB2-BmALP載體16℃下細胞裂解后上清液和沉淀the supernatant and pellet of cell lysate with pSKB2-BmALP vector at 16℃；5、6：pET32M.3C-BmALP載體16℃下細胞裂解后上清液和沉淀the supernatant and pellet of cell lysate with pET32M.3C-BmALP vector at 16℃；7、8：ppSumo-BmALP載體16℃下細胞裂解后上清液和沉淀the supernatant and pellet of cell lysate with ppSumo-BmALP vector at 16℃；9、10：ppSumo-BmALP載體37℃下細胞裂解后上清液和沉淀The supernatant and pellet of cell lysate with ppSumo-BmALP vector at 37℃

A：Ni-NTA親和層析純化His-Trx-BmALP Purification of His-Trx-BmALP via Ni-NTA affinity chromatography。M：蛋白分子量標準protein molecular weight marker；1：細胞裂解后上清液The supernatant of cell lysate；2：細胞裂解后沉淀The pellet of cell lysate；3：流經鎳柱后溶液flow-through solutions of Ni-NTA column；4—7：緩沖液洗脫組分、50、100和250 mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫組分eluted fractions by buffer, buffers with 50, 100 and 250 mmol·L-1 imidazole；箭頭指示His-Trx-BmALP條帶的位置The arrow indicated the position of His-Trx-BmALP band；B：Ni-NTA親和層析純化BmALP Purification of BmALP via Ni-NTA affinity chromatography。M：蛋白分子量標準protein molecular weight marker；1：酶切處理前溶液protein fraction before digestion；2：酶切處理后溶液protein fraction after digestion；3：流經鎳柱后溶液flow-through solutions of Ni-NTA column；4—8：緩沖液洗脫組分、10、20、100和250 mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫組分eluted fractions by buffer, buffers with 10, 20, 100 and 250 mmol·L-1 imidazole。上下箭頭分別指示了His-Trx-BmALP和BmALP條帶的位置The upper and lower arrows indicated the positions of His-Trx-BmALP and BmALP bands, respectively

2.5 BmALP蛋白溶液構象分析

利用凝膠過濾層析法分析BmALP蛋白在溶液中的分子量，進而推測其相應的蛋白狀態。結果顯示，BmALP在Superdex 200 10/300 GL凝膠層析柱上顯示為一個單一銳利的對稱峰形（圖6-A），表明BmALP折疊形成了良好的空間構象。SDS-PAGE分析顯示，該峰代表的為BmALP蛋白（圖6-B）。根據Superdex 200 10/300 GL凝膠層析柱手冊和圖6-A的出峰位置，可以初步推算出BmALP在溶液中的分子量約為110 kD，表明純化獲得的BmALP蛋白在溶液中以二聚體的形式存在。

2.6 BmALP蛋白結構分析

利用圓二色光譜法分析BmALP蛋白在溶液中的二級結構及溫度對其二級結構的影響。BmALP蛋白的圓二色光譜圖顯示，在約208和222 nm處具有兩個明顯的負峰（圖7-A），這是螺旋結構的特征峰形，表明純化獲得的BmALP蛋白含有一定的螺旋結構，與之前預測的BmALP蛋白的結構基本一致。

圖6 BmALP蛋白分子量和聚集態分析

以222 nm處的橢圓度值θ222作為BmALP蛋白螺旋結構的特征，對不同的溫度作圖從而反映溫度對BmALP蛋白二級結構的影響，結果如圖7-B所示。從圖中可以看出，隨著溫度從5℃逐漸升高至80℃，θ222絕對值不斷降低，表明在溫度的影響下，BmALP蛋白的螺旋結構逐漸減少。

圖7 BmALP蛋白結構分析

2.7 BmALP酶活性分析

在pH 3.0—6.0之間，BmALP幾乎沒有活性。隨著pH從6.0升至11.0，BmALP的催化活性逐漸升高，在pH 11.0時達到最大；當進一步升高pH至12.0時，BmALP的催化活性降至最高時的約50%；當升高pH至14.0時，BmALP幾乎完全喪失了催化活性。結果表明，BmALP酶學活性的最適pH為11.0（圖8-A）。

隨著溫度從4℃升至45℃，BmALP的催化活性逐漸升高，在45℃時達到最大；當溫度高于45℃后，隨著溫度的升高，BmALP的催化活性逐漸下降，65℃時的活性降低至最高時活性的30%左右。因此，BmALP酶學活性的最適溫度為45℃（圖8-B）。

在最適pH和最適溫度下，以NPP為底物，測出BmALP的Km值為1.40 mmol·L-1。將BmALP在不同的溫度下分別孵育2 h，然后檢測其殘余的催化活性。結果顯示，10℃時BmALP的殘余活性最高，其次是20℃和25℃。4℃時BmALP的活性約為10℃時活性的60%。30℃時BmALP的殘余活性迅速降至約為10℃時活性的28%。在35℃及更高的溫度下，BmALP完全喪失了其催化活性（圖8-C）。

圖8 BmALP酶活分析

2.8 金屬離子對BmALP酶活的影響

向反應溶液中加入不同濃度的MgCl2、ZnCl2和CuCl2，檢測BmALP的酶學活性，結果如圖9所示。從圖中可以看出，在同一種陰離子Cl-存在的情況下，Mg2+、Zn2+和Cu2+對BmALP的酶學活性表現出了截然不同的效應，Mg2+和Zn2+都促進了BmALP催化反應的進行，而Cu2+對BmALP的酶學活性則表現出了促進和抑制兩種不同的效應。在0—40 mmol·L-1，隨著Mg2+濃度的增加，BmALP的催化活性逐漸增加，40 mmol·L-1時達到最大，其激活效應最大可以達到最初活性的8倍；進一步增加Mg2+濃度，BmALP的催化活性相比最高時有所下降，在60 mmol·L-1時仍然約為最初活性的5.5倍（圖9-A）。

Zn2+對BmALP酶活的激活效應與Mg2+相似。在0—5 mmol·L-1，隨著Zn2+濃度的增加，BmALP的催化活性逐漸增加，5 mmol·L-1時達到最大，其激活效應最大可以達到最初活性的9倍；進一步增加Zn2+濃度，BmALP的催化活性相比最高時逐漸下降，在40 mmol·L-1時仍然約為最初活性的2.5倍（圖9-B）。Cu2+對BmALP的效應與Mg2+和Zn2+不同。在0—10 mmol·L-1以內，隨著Cu2+濃度的增加，BmALP的催化活性逐漸增加，10 mmol·L-1時達到最大，其激活效應最大可以達到最初活性的1.7倍；進一步增加Cu2+濃度，BmALP的催化活性相比最高時逐漸下降，20 mmol·L-1時與最初的活性相當；當Cu2+濃度超過20 mmol·L-1后，BmALP的活性繼續下降，Cu2+對BmALP的活性表現出抑制效應；當Cu2+濃度達到40 mmol·L-1時，BmALP的活性約為其最初活性的50%（圖9-C）。

圖9 金屬離子對BmALP酶活的影響

3 討論

ALP是生物體內調控磷酸代謝的關鍵酶。不同物種ALP的性質因進化差異而有所不同，同一物種ALP的同工酶性質可能也不相同。本文從家蠶大造品種中腸克隆獲得了一種，并將其構建到原核細胞表達載體，借助大腸桿菌表達系統，獲得了在細胞裂解后的上清液中表達的可溶性BmALP蛋白，利用Ni-NTA親和層析法純化獲得了BmALP，并通過凝膠過濾、圓二色光譜和酶學活性分析詳細研究了其溶液構象、二級結構和酶學性質，為深入揭示其生理功能和分子調控機理打下了基礎。

分子進化分析表明堿性磷酸酶在低等和高等生物中氨基酸序列相當保守，暗示了堿性磷酸酶在大多數生物的生命活動過程中都具有極其重要的生理功能。Okada等從其他品系家蠶的中腸純化了ALP蛋白[13,41]，本文從家蠶大造品種的中腸克隆獲得了，暗示了ALP可能在不同品系的家蠶中腸中廣泛存在。盡管所有的家蠶ALP同工酶都包含有保守的堿性磷酸酶結構域，不同ALP的氨基酸序列和性質還是存在一定的差異，反映了家蠶由于地域（日本品種和中國品種）和品系（大造和PMY000）分化在進化過程中所產生的差異。本文選擇的大造與李長春等[41]選擇的PMY000同為中國品種，二者的ALP同工酶大部分性質比較相似，比如分子量都約為55 kD，形成了同源二聚體，但也存在一些細小的不同，比如大造ALP最適pH為11.0，PMY000的ALP最適pH為10.5；大造ALP最適溫度為45℃，PMY000的ALP最適溫度為40℃。當然，這種最適pH和最適溫度的差異可能是由于二者測活方法不同所導致，如大造ALP的酶活分析以NPP為底物，而PMY000的ALP測活則以磷酸苯二鈉為底物。PMY000的ALP在25℃下放置5 h不損失活性，50℃下放置5 h約損失了30%活性[41]，而大造ALP在25℃下放置2 h已經損失了約30%活性，35℃下放置2 h則完全喪失了活性，表明大造ALP不如PMY000的ALP結構穩定。大造和PMY000 ALP的Km分別為1.40和1.25 mmol·L-1，表明PMY000 ALP對底物有更高的親和力。PMY000是從家蠶基因資源庫100多個品種中篩選出的ALP活性最高的品種，而大造是一般的試驗品種，二者結構穩定性和Km值的差異反映了其ALP活性的不同，而ALP的活性一定程度上可以反映出家蠶的生理狀況。與試驗品種大造相比，實用品種PMY000容易飼養，生長速度快。

酶活分析表明，升高溫度可以加速BmALP催化反應的進行，提高酶的催化活性，但也可能因溫度升高引起BmALP構象變化而導致其活性下降。從4℃升至45℃的過程中，高溫加速效應大于其失活效應，因此表現出酶活的升高；從45℃升至65℃的過程中，高溫引起的失活效應大于其促進效應，從而導致了BmALP催化活性的下降。沙漠蝗、蚊類和煙粉虱ALP的最適溫度分別為40、37和47℃[32-34]，與家蠶ALP的最適溫度差別不大，顯示出不同物種昆蟲ALP活性位點的關鍵氨基酸殘基及其空間構象相對保守。有趣的是，家蠶的最適飼養溫度為25—28℃，一般不會超過30℃。家蠶大造和PMY000的ALP最適溫度分別為45和40℃，這種差異可能是因為體外酶活分析的試驗條件與體內酶發揮催化功能的真實生理環境不一致所導致，如體外試驗一般以小分子化合物如pNPP為底物，而體內ALP的底物則是磷酸化的蛋白質。家蠶ALP的最適pH在9.8—11.0，這與家蠶中腸的生理環境基本一致。煙粉虱和白粉虱ALP最適pH均為7.8[32]，沙漠蝗中腸ALP最適pH為7.4[33]，其附肢ALP最適pH為6.5[27]，顯示出不同昆蟲ALP及其同工酶性質的差異，這可能與ALP在不同物種和組織中執行不同的生理功能有關。

BmALP蛋白包含8個半胱氨酸殘基，在大腸桿菌中表達可能會影響其折疊形成正確的空間構象[47]。氨基酸疏水性分析顯示，BmALP蛋白包含有相當高比例的疏水性氨基酸殘基（圖2-A），這些疏水性氨基酸同樣可能會影響到BmALP在大腸桿菌中的表達、折疊和構象的穩定。之前嘗試利用BL21 (DE3)和Rosetta (DE3)細胞表達BmALP，發現重組蛋白主要以包涵體的表達形式出現在沉淀中，后來將其與pET32M.3C載體相連，并利用Origami (DE3)細胞獲得了可溶性表達的重組蛋白。凝膠過濾分析顯示，BmALP在溶液中形成了二聚體。這個銳利、近乎對稱的峰形反映出純化的BmALP蛋白折疊形成了良好的空間構象，在溶液中僅存在一種構象狀態。圓二色光譜結果表明BmALP在溶液中具有螺旋結構，與之前生物信息學的分析一致。酶活分析顯示純化的BmALP具有良好的催化活性，表明Trx標簽和Origami (DE3)細胞共同作用，促進了重組表達的BmALP折疊形成正確的空間構象。結構分析表明，BmALP主要由螺旋結構包裹片層的堿性磷酸酶結構域組成，隨著溫度逐漸升高，其螺旋結構持續被誘導發生去折疊，沒有明顯的過渡態中間體形式存在，而酪氨酸磷酸酶在脲和鹽酸胍誘導的去折疊過程中，則可以形成明顯不同的中間體結構[46]，顯示了不同的磷酸酶在分子構象和蛋白質折疊途徑中存在一定的差異。酶活分析顯示，在4—10℃范圍內，BmALP的構象比較穩定，高溫有利于BmALP催化反應的進行，因此10℃時BmALP的殘余活性最大；當溫度超過10℃時，升溫引起了BmALP活性位點的構象變化，從而導致其殘余活性下降。35℃及以上，BmALP的活性位點構象幾乎完全被破壞，因此導致其活性基本完全喪失。

ALP是一種金屬酶。本研究中Mg2+和Zn2+對BmALP的酶活都表現出促進效應，其最適濃度分別為40和5 mmol·L-1，超過此濃度則其促進效應有所下降。Mg2+和Zn2+同樣可以幫助被EDTA抑制的家蠶ALP同工酶部分恢復活性[29]，表明Mg2+和Zn2+對家蠶ALP構象和酶學活性至關重要。低濃度的Cu2+對BmALP的酶活有一定的激活效應，但高濃度的Cu2+則顯著地抑制了BmALP的活性。而Zn2+和Cu2+則對鮑魚和白蠟蟲ALP酶活都表現出抑制效應[30,48]，顯示出不同的金屬離子在不同物種ALP維系其空間構象和催化反應過程中發揮著不同的作用。

4 結論

從家蠶中腸克隆了，構建了原核表達載體，表達純化了可溶性家蠶BmALP蛋白，發現其包含有-螺旋結構，在溶液中形成了穩定的二聚體結構。BmALP酶活最適pH為11.0，最適溫度為45℃，Km為1.40 mmol·L-1，在低溫下其構象穩定，溫度高于35℃，BmALP的活性迅速喪失。Mg2+和Zn2+對BmALP的酶活具有促進作用，低濃度的Cu2+可以激活BmALP，高濃度的Cu2+則抑制其活性。

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（責任編輯 岳梅）

Expression, purification, structure and activity analysis of alkaline phosphatase of

HE Huawei1,2,3, WANG Yejing2, HOU Li2, LI Yu1, WEI Shuguang1, ZHAO Peng1, JIANG Wenchao1, ZHAO Ping1

(1State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715;2College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715;3Chongqing Engineering and Technology Research Center for Novel Silk Materials, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】Alkaline phosphatase (ALP) is the key enzyme in the metabolism of phosphoric acid. The properties of ALP in different species are closely related to their physiological functions. The characterization of the property and structure ofALP (BmALP) will facilitate to reveal the physiological function and regulation mechanism of ALP in insects. 【Method】The total RNA was extracted by Trizol method from the midgut oflarvae on day 3 of the 5th instar, and then cDNA was synthesized with the extracted total RNA as the template by reverse transcription. The upstream and downstream primers were designed by Primer Premier 6.0 software, andwas cloned with the synthesized cDNA as the template by PCR.and different expression vectors were double digested, respectively, then ligated and transformed into the expression strain. The recombinant protein was expressed by. The expressions of different expression vectors in the supernatant were compared, and the vector with the best expression of soluble recombinant protein was chosen. The recombinant protein was expressed in large scale using Origami B (DE3) cells, and digested with Prescission protease at 4℃ for 20 h followed by the purificationNi-NTA affinity chromatography. Then the fusion His-Trx tag was removed using Ni-NTA affinity column again. The molecular weight and the state of BmALP in solution were analyzed by gel filtration chromatography. The secondary structure of BmALP and the effects of temperature on its structure were studied by circular dichroism spectroscopy. The optimum pH, optimum temperature, Km, structural stability and the effect of metal ions on the activity of BmALP were studied by the activity assay.【Result】 The total RNA was extracted from the midgut ofand cDNA was synthesized by reverse transcription.was successfully cloned with the cDNA as the template. The expression vectors of BmALP with pSKB2, ppSUMO and pET32M.3C were constructed, respectively. The expression analysis showed that the pET32M.3C vector facilitated the expression of the recombinant fusion protein His-Trx-BmALP in the form of a soluble protein in the supernatant of cell lysate. Then the recombinant BmALP was expressed in large scale with the pET32M.3C vector. The soluble recombinant His-Trx-BmALP was purifiedNi-NTA affinity chromatography. After the digestion of His-Trx-BmALP by Prescission protease, the fusion His-Trx tag was removed by Ni-NTA affinity column. Gel filtration analysis showed that BmALP formed a stable dimer in solution. Circular dichroism spectroscopy showed BmALP contained-helical structure, and its content decreased with increasing temperature. Enzymatic activity analysis revealed that the optimum pH and temperature of BmALP were 11.0 and 45℃, respectively. The Km of BmALP was measured to be 1.40 mmol·L-1. After 2 h incubation at 10℃, BmALP had the highest residual activity, and the residual activity was completely lost after incubation at 35℃ for 2 h. Mg2+and Zn2+promoted the catalytic reaction of BmALP with the optimal concentration of 40 and 5 mmol·L-1, respectively. Cu2+activated BmALP activity within 20 mmol·L-1, and the optimal concentration was 10 mmol·L-1, however, Cu2+inhibited the activity of BmALP while its concentration was higher than 20 mmol·L-1.【Conclusion】was cloned. BmALP protein was expressed and purified and its structure and properties were analyzed. The results of this study provided a basis for further study of its structure and function.

; alkaline phosphatase; expression and purification; structure; property

2017-01-17；接受日期：2017-03-10

國家自然科學基金（31402139，31572465）、國家自然科學基金重點項目（31530071）、重慶市基礎科學與前沿技術研究專項（cstc2015jcyjA00040，cstc2015jcyjBX0035）、中央高校基本科研業務費（XDJK2013A019）、西南大學博士基金（SWU112111）

何華偉，E-mail：hehuawei@swu.edu.cn。通信作者王葉菁，Tel：023-68251575；E-mail：yjwang@swu.edu.cn