姬松茸子實(shí)體多糖高速剪切提取及其抗氧化活性

劉曉慶 秦春青 孫培龍 張安強(qiáng)

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姬松茸子實(shí)體多糖高速剪切提取及其抗氧化活性

劉曉慶 秦春青 孫培龍 張安強(qiáng)*

（浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)系，浙江杭州 310014）

姬松茸多糖具有顯著的抗腫瘤、抗疲勞、抗突變、抗氧化等功能。為提高姬松茸多糖得率、縮短提取時間，而采用高速剪切提取技術(shù)從姬松茸子實(shí)體中提取多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝。最終確定最佳提取條件為液料比27 mL/g，轉(zhuǎn)速22 000 r/min，剪切時間6.60 min，此時多糖實(shí)際得率為（12.33±0.020）%，與預(yù)測值12.48%相近。并通過乙醇梯度沉淀獲得ABM40、ABM60、ABM80 3個姬松茸多糖組分，進(jìn)而對其進(jìn)行體外抗氧化活性測定。結(jié)果表明，3個多糖組分均表現(xiàn)出良好的ABTS自由基和DPPH自由基的清除能力，且具有一定的還原力。

姬松茸；多糖；高速剪切提取；抗氧化

姬松茸（Murill，ABM）又名巴西蘑菇，原產(chǎn)于巴西，是一種藥食兼用的珍稀食用菌，在巴西和日本常用來治療癌癥、心臟病、肥胖癥等疾病[1,2]。大量研究表明：姬松茸多糖具有顯著的抗腫瘤[3]、抗疲勞[4]、抗突變[5]、抗氧化[6]等功能。因此，提高和簡化姬松茸多糖的提取工藝對有效利用姬松茸資源至關(guān)重要。目前，提取姬松茸多糖的常用方法有熱水浸提、復(fù)合酶提取、微波或超聲波輔助提取等[7～9]，熱水浸提法雖操作簡單但耗時過長；復(fù)合酶提取雖條件溫和、雜質(zhì)易除，但酶易失活且成本較高；微波或超聲波輔助提取縮短了提取時間，然而仍需數(shù)小時。高速剪切技術(shù)作為近年來發(fā)展起來的一種均質(zhì)化技術(shù)，已廣泛用于天然產(chǎn)物提取、分離和改性方面[10]。它主要通過負(fù)壓、剪切、高速碰撞等各種外力作用使原料中的有效成分迅速擴(kuò)散到溶劑中，在短時間內(nèi)達(dá)到溶解平衡[11]。李麗等利用高速剪切技術(shù)破碎油菜蜂花粉細(xì)胞壁，使花粉破壁率達(dá)到99%以上，并提高了其黃酮提取率[12, 13]。魏鑒騰等采用高速剪切技術(shù)輔助提取滸苔多糖，剪切時間80 s，剪切3次便可使多糖得率達(dá)到17.19%[10]，大大縮短了提取時間。而高速剪切技術(shù)應(yīng)用于姬松茸子實(shí)體多糖提取仍未見報道。

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，最終確定最佳提取工藝；并通過乙醇梯度沉淀獲得ABM40、ABM60、ABM80三個姬松茸多糖組分，進(jìn)而對其體外抗氧化活性進(jìn)行了測定。

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑、儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

姬松茸子實(shí)體由杭州百山祖生物科技有限公司提供，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔡為明研究員鑒定；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS、DPPH，為美國Sigma公司產(chǎn)品；苯酚、濃硫酸、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、3,5-二硝基水楊酸等其他化學(xué)試劑，為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

AL-104電子天平（METTLER TOLEDO有限公司），F(xiàn)A25型高剪切分散乳化機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造公司），V-1800PC型可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器公司），CR21GII型高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi（日立）公司），RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 姬松茸子實(shí)體多糖提取

姬松茸子實(shí)體經(jīng)95%乙醇脫脂干燥后，粉粹，并以水為溶劑，在一定液料比和轉(zhuǎn)速下高速剪切提取。提取液以10 000 r/min速率離心10 min，棄去沉淀收集上清液。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至體積為原體積的1/10后即得粗多糖濃縮液。濃縮液經(jīng)Sevag法除去蛋白（重復(fù)6次）后向其加入95%乙醇使乙醇濃度分別達(dá)到40%、60%、80%，各組分離心所得沉淀命名為ABM40、ABM60、ABM80；加水復(fù)溶，揮干殘留的乙醇后冷凍干燥可得3個組分的多糖粗提物。

2.2 姬松茸子實(shí)體多糖高速剪切提取條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。對液料比（10、15、20、25、30 mL/g）、轉(zhuǎn)速（13 000、16 000、19 000、22 000、25 000 r/min）、剪切時間（1、2、4、6、8 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察這3個因素對姬松茸子實(shí)體多糖得率的影響并初步確定各因素的取值范圍。

（2）響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲取最優(yōu)提取工藝條件。

（3）姬松茸子實(shí)體多糖含量的測定。用苯酚硫酸法[14]和DNS法[15]分別測定姬松茸子實(shí)體粗多糖的總糖含量和還原糖含量，按式（1）計(jì)算即得姬松茸子實(shí)體的多糖含量。

多糖含量 = 總糖含量-還原糖含量（1）

（4）姬松茸子實(shí)體多糖得率的計(jì)算：

得率（%）=（2）

2.3 姬松茸子實(shí)體粗多糖（ABM40、ABM60、ABM80）的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

（1）ABTS 自由基清除能力[16]。取8 mL 7 mmol/L ABTS與141 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，在4 ℃下避光反應(yīng)12～16 h，用pH=7.4的磷酸緩沖液將ABTS自由基溶液稀釋至OD=0.7±0.02備用。

各取1 mL不同濃度的粗多糖溶液于試管中，各加入3 mL ABTS自由基溶液，在30 ℃下，避光反應(yīng)5 min，于734 nm處測定吸光值。以蒸餾水為參比溶液，Vc作為陽性對照組。

ABTS自由基清除率（%）=

式（3）中：A0為空白對照組的吸光值；Ai為樣品測定管的吸光值；Aj為樣品本底管的吸光值。

（2）DPPH自由基清除能力[17]。各取3 mL不同濃度的粗多糖溶液于試管中，加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，密封混勻，在25 ℃條件下恒溫避光反應(yīng)1 h，并在517 nm處測定吸光值。以甲醇溶液為參比溶液，Vc作為陽性對照組。

DPPH羥基自由基清除率（%）=

式（4）中：A0為空白對照組的吸光值；Ai為樣品測定管的吸光值；Aj為樣品本底管的吸光值。

（3）還原力的測定[18]。各取2.5 mL不同濃度的粗多糖溶液于試管中，加入2.5 mL磷酸緩沖液（pH=6.6，0.2 mol/L）和2.5 mL 1 %的鐵氰化鉀溶液，振蕩均勻， 50 ℃反應(yīng)20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。室溫離心（8 000 r/min，10 min）后，取上清液2 mL于試管中，加入2 mL 蒸餾水和0.4 mL 0.1%氯化鐵溶液，搖勻后反應(yīng)10 min 在700 nm處測定吸光值。以蒸餾水為參比溶液，Vc作為陽性對照組。

還原力=Ai－A0（5）

式（5）中：A0為空白對照組的吸光值；Ai為樣品測定管的吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）不同液料比的多糖得率。取10 g 姬松茸子實(shí)體粉末，按不同液料比（10、15、20、25、30 mL/g）加入蒸餾水，在25 000 r/min的轉(zhuǎn)速下室溫剪切提取6 min，提取液經(jīng)離心（10 000 r/min，10 min）后取上清液測其多糖含量。由圖1可知，多糖的得率隨液料比的增大而大幅度提高，但當(dāng)液料比大于25 mL/g時，得率趨于穩(wěn)定。因此，選用液料比20、25、30 mL/g為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中料液比的因素水平。

（3）不同剪切時間的多糖得率。取10 g 姬松茸子實(shí)體粉末，按液料比為20 mL/g加入蒸餾水，在25 000 r/min轉(zhuǎn)速下，以不同的剪切時間（1、2、4、6、8 min）進(jìn)行提取，提取液經(jīng)離心（10 000 r/min，10 min）后取上清液測其多糖含量。由圖3可知，當(dāng)剪切時間小于4 min時，得率隨剪切時間的增加而增加，大于6 min 后其得率基本不變，說明繼續(xù)延長剪切時間對提高多糖得率無明顯作用。因此選用剪切時間4、6、8 min 進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同料液比對多糖得率的影響

圖2 轉(zhuǎn)速對多糖得率的影響

圖3 剪切時間對多糖得率的影響

3.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）分析因素的選取及分析方案。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用表1所示的因素水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以A、B、C為自變量，姬松茸多糖的得率為響應(yīng)值Y，實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果如表2所示；一共17組實(shí)驗(yàn)，其中10 ~ 14 為中心試驗(yàn)，其他為析因試驗(yàn)。

（2）回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn)。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合后得到一個二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=12.38+0.14A+0.29B+0.13C+0.080AB+0.098AC-0.025BC-0.23A2-0.49B2-0.27C2

回歸方程的方差分析見表3。方差分析可用來評估預(yù)測模型的準(zhǔn)確性，各項(xiàng)系數(shù)的顯著性可由F值和P值檢驗(yàn)，P值越小越顯著[19]。回歸模型的F=89.54（P <0.0001），說明模型極顯著；失擬項(xiàng)F=0.68（P=0.6082>0.05）以及R2=0.9914，R2adj=0.9803，更進(jìn)一步說明此數(shù)學(xué)模型可以用來預(yù)測高速剪切提取姬松茸多糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及最優(yōu)提取條件。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，液料比、轉(zhuǎn)速、剪切時間的一次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平（P<0.001）。此外液料比和轉(zhuǎn)速，液料比和剪切時間的交互作用也達(dá)到顯著水平（P<0.05）。由F值可得出，各因素對姬松茸多糖的得率影響次序?yàn)檗D(zhuǎn)速>液料比>剪切時間。

（3）響應(yīng)面分析。圖4～6為各交互因素的等高線圖和響應(yīng)面圖，反映了各因素的交互作用

與類似，當(dāng)和分別等于零時，式(12)中的P、Lv和Mv分別為0，可得其交點(diǎn)軸線T-Map的3維空間域邊界方程分別為：

對響應(yīng)值的影響。等高線圖的形狀可用來判斷因素間交互作用是否顯著，橢圓形表示因素間交互作用顯著，而圓形則反之[20]。從圖4a、圖5a可以看出AB、AC因素間交互作用顯著，而圖6a中的BC因素間交互作用不顯著。

表3 回歸方程各項(xiàng)方差分析

注： ***表示p<0.001水平顯著，**表示0.001

（4）最佳工藝條件的確定。由Design Expert 8.0 軟件可得提取姬松茸多糖的最佳工藝條件為液料比27.12 mL/g，轉(zhuǎn)速22 959.37 r/min，剪切時間6.59 min，此時多糖得率為12.48%。考慮實(shí)際情況及操作的可行性，確定最佳提取條件為液料比27 mL/g、轉(zhuǎn)速22 000 r/min、剪切時間6.60 min。在此條件下，重復(fù)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得實(shí)際多糖得率為（12.33±0.020）%，與預(yù)測值12.48%相近。說明該模型可靠，可預(yù)測實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.3 體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）ABTS 自由基清除能力。ABTS自由基清除法目前已被廣泛應(yīng)用于生物樣品的總抗氧化能力的測定。ABTS經(jīng)氧化可生成相對穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS自由基水溶液，若與抗氧化劑反應(yīng)可使其溶液褪色，溶液顏色褪色越明顯，說明該物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)[21]。姬松茸子實(shí)體粗多糖ABM40、ABM60、ABM80 的ABTS 自由基清除能力如圖7所示：在一定濃度范圍內(nèi)，ABM40、ABM60、ABM80的ABTS 自由基清除能力均與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系；ABTS 自由基清除能力由大到小的順序?yàn)閂c>ABM80>ABM60>ABM40；當(dāng)濃度大于1.5 mg/mL時，3個組分的ABTS 自由基清除率接近100%，說明姬松茸子實(shí)體粗多糖具有較好的ABTS 自由基清除能力。

（2）DPPH自由基清除能力。DPPH自由基是一個以氮為中心的脂溶性自由基，在電子供體即抗氧化劑的存在下，穩(wěn)定的DPPH自由基由紫色轉(zhuǎn)化為黃色[22，23]。由圖8可知，當(dāng)樣品濃度小于1.2 mg/mL時，DPPH自由基清除能力大小順序?yàn)閂c>ABM80>ABM60>ABM40；而當(dāng)濃度大于1.5 mg/mL，DPPH自由基清除能力大小順序改變?yōu)閂c>ABM40>ABM60>ABM80，并且ABM40組分在濃度為1.8 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率達(dá)到86.24 %。

（3）還原力的測定。抗氧化劑能夠通過自身的還原作用給出電子使自由基變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性；還原力越大，抗氧化能力就越強(qiáng)，因此可根據(jù)Fe3+還原為Fe2+的多少來間接評價樣品的抗氧化能力[24]。圖9顯示3個組分的還原力均具有濃度依賴性，其隨樣品濃度的增加而增強(qiáng)，ABM80組分的還原力最強(qiáng)，ABM60，ABM40為最弱。

圖7 ABTS 自由基清除能力

圖8 DPPH自由基清除能力

圖9 還原力

4 結(jié) 論

本研究將高速剪切技術(shù)首次應(yīng)用于姬松茸子實(shí)體多糖的提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，最終確定最佳提取條件為液料比27 mL/g、轉(zhuǎn)速22 000 r/min、剪切時間6.60 min。在此條件下，多糖實(shí)際得率為（12.33±0.020）%，與預(yù)測值12.48 %相近。此方法與傳統(tǒng)提取方法——熱水浸提相比，不僅提高了多糖的得率，大大縮短了提取時間，而且還可在常溫水環(huán)境中提取，減少能耗。通過乙醇梯度沉淀獲得ABM40、ABM60、ABM80 3個姬松茸多糖組分，體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：3個多糖組分均表現(xiàn)出良好的ABTS自由基、DPPH自由基清除能力，且具有一定的還原力。本研究以期為將姬松茸多糖工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用于保健食品提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Optimization of polysaccharides extraction fromMurill by high-speed shear technique and their antioxidant activities

Liu Xiaoqing Qin Chunqing Sun Peilong Zhang Anqiang*

( Department of Food Science and Technology, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China )

Polysaccharides fromMurill have remarkable functions, such as antitumor, antifatigue, antimutagen, antioxidant and so on. In order to improve the extraction yield and shorten the extraction time, HSDE (High-Speed Shear Dispersing Emulsifier) is used to extract polysaccharides fromMurill. The extraction parameters were optimized by using a three-variable-three-level Box-Behnken design and a response surface methodology (RSM) based on the single-factor experiments. The optimum conditions were predicted as follows: ratio of water to raw material 27 mL/g; rotate speed 22000 r/min; extraction time 6.60 min, and the highest extraction yield reached 12.33±0.020% under these conditions, which was in good agreement with the predicted value 12.48 %. In addition, three fractions (ABM40, ABM 60 and ABM80) were obtained by the ethanol precipitation method and showed appreciable antioxidant potential on ABTS radical scavenging activity, DPPH radical scavenging capacity and a certain reducing power.

Murill; polysaccharides; high-speed shearing; antioxidant

S646

A

2095-0934（2017）02-113-07

國家自然基金項(xiàng)目“姬松茸α-葡聚糖綴合物高持水性特征內(nèi)在分子機(jī)制研究”（31671813）

劉曉慶（1992-），女，研究生

張安強(qiáng)，男，副教授。E-mail：zhanganqiang@zjut.edu.cn