黑曲霉C2J6對環己酮的細胞耐受性機制

蘇雪林，張梓涵，劉婭

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黑曲霉C2J6對環己酮的細胞耐受性機制

蘇雪林1，張梓涵2，劉婭1

(1石河子大學食品學院，新疆石河子 832000；2新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆烏魯木齊 830011)

鑒于黑曲霉C2J6在有機溶劑中的菌體生長和酶活性與其細胞耐受性有關，為揭示菌體對有機溶劑的耐受規律和耐受性機制，考察了菌體對15種有機溶劑的耐受性，并從細胞水平上探究了菌體在疏水性較低的環己酮中的耐受性機制。結果表明：黑曲霉C2J6可以在多種有機溶劑中生長產酶，lg為-0.24～3.0的有機溶劑對菌體生長及產酶有不同程度的抑制作用，而lg>3.0的有機溶劑則起到相應的促進作用。環己酮脅迫下，細胞膜表面出現破損，胞內細胞器有皺縮現象，細胞表面疏水性下降，胞外核苷酸濃度上升，細胞膜不飽和脂肪酸含量降低，飽和脂肪酸含量增加。說明菌體對環己酮的耐受性涉及多個方面，多種耐受機制同時存在，使環己酮對細胞的毒害大大降低，從而提高了微生物的耐受能力。

黑曲霉；脂肪酶；有機溶劑；環己酮；細胞耐受性機制

引 言

耐有機溶劑微生物是一類新穎的極端微生物。這類微生物為了能在極端環境中生存，漸漸形成了自身獨特的結構和生理特征，其中一些微生物還能產生耐受極端環境的酶類等代謝產物，如耐有機溶劑脂肪酶、蛋白酶等，給非水相酶催化領域的應用和發展帶來了新的突破口。因此，耐有機溶劑酶類已經成為生物催化領域中的一個研究熱點。其中，研究有機溶劑對微生物的毒害及微生物對有機溶劑的耐受性機理成為關鍵。已有研究表明，有機溶劑對微生物的毒害存在菌體特異性[1]，毒害的大小與有機溶劑的lg值有關[2-7]。lg表示有機溶劑在辛醇和水中的分配系數，lg值越低，表示該溶劑的疏水性越強。此外，還與有機溶劑的化學性質有關[8]，如在含有辛烯的培養基中不能存活，但在同等lg值的甲基環六烷存在下，卻可以生存。通常微生物對有機溶劑的耐受機理包括細胞形態變化[9]、囊泡外排[10-11]、改變細胞膜磷脂的結構和組成[12-15]等。微生物體內存在多種耐受機制，這些機制一般不是單獨存在，而是多種機制共同發揮作用來應對復雜的生存環境。

目前，我國對耐有機溶劑微生物及其耐受性機制的研究尚處于起步階段，關于微生物對有機溶劑的單一耐受性機制報道較多，但對具體微生物綜合耐受機制的研究相對較少。本文以有機溶劑耐受菌黑曲霉C2J6為受試菌株，選取多種不同lg值的有機溶劑作為菌體培養基的碳源，了解菌體對不同有機溶劑的耐受規律，然后從中選取lg值較低、耐受性較好的環己酮培養菌體，從細胞水平上探討其多種耐受性機制，以期為后續從代謝組學和蛋白質組學角度的深入研究提供參考。此外，掌握微生物對有機溶劑的耐受性機制，有利于靶向提高微生物細胞的耐受性，對于開發極端微生物資源、充分利用微生物特殊生理功能，開發全細胞催化劑[16]和環境修復菌株、促進綠色化工、環境污染修復、酶制劑的開發等具有重要的理論意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株

有機溶劑耐受菌黑曲霉C2J6，源自葡萄，由本實驗室自行分離。

1.2 實驗藥品

對硝基苯酚棕櫚酸酯：分析純，Sigma；亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯：色譜純，Sigma；正庚烷：色譜純，Fisher Scientific；石油醚、丙醇、甲苯、正己烷、乙醇、乙酸乙酯：分析純，西隴化工廠有限公司；吡啶、丙酮、乙酸、環己酮、苯酚、四氯化碳、苯、二氯甲烷、異丙醇：分析純，北京化工廠。

1.3 實驗設備

OLYMPUS-CX41生物顯微鏡，北京卓信偉業科技有限公司；UH5300雙光束分光光度計，日本日立（HITACHI）公司；JEM-1400透射電鏡，日本電子株式會社；Vortex-genie 2通用旋渦混勻器，北京卓信偉業科技有限公司；GC-450氣相色譜儀，布魯克(Bruker)公司；MS-320氣相色譜-四級桿質譜系統，布魯克(Bruker)公司。

1.4 培養基

固體培養基：馬鈴薯粉6 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

液體培養基：葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

發酵培養基：FeSO4·7H2O 0.01 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，NH4Cl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，CaCl20.1 g·L-1，KCl 0.1 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，橄欖油乳化劑(4%聚乙烯醇:橄欖油=3:1)10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

1.5 菌體干重測定

將不同lg值的15種有機溶劑按1%添加到黑曲霉發酵培養基中，經發酵培養后的液體在恒重的濾紙上真空抽濾，得到菌絲體后用蒸餾水沖洗3次，于烘箱中70℃干燥至恒重，冷卻后稱量，計算菌絲體干重。

1.6 脂肪酶活性測定

以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物，在分光光度計405 nm波長下測定脂肪酶活性[17]。

1.7 菌體細胞形態觀察

細胞切片的制備：將黑曲霉細胞放入盛有戊二醛固定液的離心管中固定24～48 h，用磷酸緩沖液沖洗菌體后加入鋨酸再固定90 min，清洗，酒精脫水。再用等比例的樹脂和酒精浸泡菌體，期間更換樹脂。60℃包埋48 h使樹脂聚合，切成70 nm的切片備用。

切片染色：切片用醋酸鈾染色5 min，再用0.02 mol·L-1NaOH染色2 min，重蒸水洗去多余的染色液，干燥后用透射電鏡觀察。

1.8 細胞表面疏水性檢測

細胞的表面疏水性采用微生物碳氫吸附能力法（MATH）[18-19]，測定3次，求平均值。計算公式如下

1.9 菌體胞外核苷酸測定

調整黑曲霉發酵液光密度在0.1～1.0范圍內，在波長260 nm下測定吸光值。260 nm下1 mg·ml-1DNA吸光值為0.02，1 mg·ml-1RNA吸光值為0.022，核苷酸的濃度計算公式如下

(3)

式中，為核苷酸濃度，mg·ml-1；為樣品吸光值。

1.10 細胞膜脂肪酸組成分析

細胞膜脂肪酸首先進行甲酯化[20]，再用氣相色譜儀測定其中脂肪酸含量。脂肪酸甲酯化步驟：將待測細胞置于圓底燒瓶中，加入8 ml 2% NaOH溶液，燒瓶放入沸水浴中加熱回流，直到燒瓶中油滴消失。再加入7 ml 5% BF3溶液，繼續沸水浴2 min，停止加熱，迅速冷卻至室溫。然后加入約20 ml正庚烷溶液，振搖2 min，待分層后，吸取上清液5 ml于試管中，加入3～5 g無水Na2SO4，振搖1 min，靜置5 min，得到上層液體待測。GC分析檢測條件：采用DB-23毛細管柱（美國 Agilent公司產品，柱長30 m，內徑0.25 mm，內膜厚度0.25 μm）。起始溫度140℃，以4℃·min-1升至240℃，保持8 min，流速1 ml·min-1，采用氫火焰離子檢測器溫度200℃，進樣量2 μl，樣品自動進樣檢測。

2 結果與分析

2.1 菌體對有機溶劑的耐受規律

為了考察有機溶劑對黑曲霉C2J6的影響，選取了15種不同lg值的有機溶劑，包括醇類、醚類、醛類、酮類等。有機溶劑對應的lg值[21-22]見表1。將有機溶劑按1%加入到發酵培養基中，再分別接入2%的黑曲霉C2J6種子液，28℃、150 r·min-1下搖床振蕩培養72 h。以沒有加入有機溶劑的發酵培養基為空白對照。測定菌體干重及脂肪酶活力，結果如圖1所示。

表1 有機溶劑的lgP值

由圖1可知，C2J6在15種不同有機溶劑中均有生長和脂肪酶活，但在不同有機溶劑中的表現有所差異。與對照相比，添加乙醇的培養基中，菌體的生長和產酶情況最差，干重較對照低71.67%，脂肪酶活力比對照低94.94%；而在添加四氯化碳、正己烷和石油醚的情況下，菌體生長和產酶能力較好，菌體干重分別增加了26.67%、51.11%和63.33%，脂肪酶活力分別增加了2.43%、7.57%和15.90%。根據溶劑lg發現其值在-0.24～3.0之間時，有機溶劑對菌體生長及產酶有不同程度的抑制；而lg>3.0時，則呈現出促進作用。圖1中，黑曲霉C2J6菌體干重及脂肪酶活性與lg值并沒有嚴格的相關性，說明菌體生長和產酶能力與不同有機溶劑的特性有關[23]，還與菌體自身的結構有關。圖2將有機溶劑對黑曲霉的毒性與有機溶劑的疏水性參數lg進行關聯，以脂肪酶活性作為有機溶劑抑制黑曲霉細胞活性的響應。由圖2可知，有機溶劑的lg與有機溶劑對脂肪酶活性的抑制作用存在一定的關聯性，其相關系數2=0.944。隨著lg值的增大，有機溶劑對脂肪酶的抑制作用逐漸減小，這可以作為選擇有機溶劑進行非水相酶催化的依據。

2.2 環己酮對細胞形態、菌體生長及酶活力的影響

從15種有機溶劑中選取lg值較低、有機溶劑耐受性相對較好的環己酮，將其分別以1%和5%的比例添加于發酵培養基中，觀察細胞形態，測定菌體干重及脂肪酶活力。由圖3及圖4可知，透射電鏡下正常黑曲霉C2J6的細胞結構完整清晰，細胞膜分明，表面飽滿光滑，結構致密，緊貼細胞膜的外圍黏附著一圈大小均一的小顆粒狀代謝產物，沒有褶皺，菌體生長良好，產酶能力較強。添加1%環己酮后整個細胞仍然清晰可見，但細胞切面呈現不規則的橢圓形，細胞膜內外邊緣都出現了暈圈，細胞膜邊界模糊不清，外層細胞膜多處有破損，內層細胞膜基本保持完整，菌體干重減小了13.37%，脂肪酶活力下降了32.84%。而5% 培養的細胞，細胞雖然較完整，但胞內細胞器有皺縮現象，細胞器只約占整個細胞的1/3，其外部被一層不規則薄膜包裹，菌體干重和酶活力僅為對照組的49.42%及41.67%。實驗表明黑曲霉在環己酮的存在下，細胞形態會發生變化，且環己酮濃度越高對細胞的破壞越嚴重，菌體生長變差，產酶能力減弱。這可能是因為細胞通過改變自身形態及細胞比表面積來抵御有機溶劑的毒害，使得菌體能夠生長，同時也保持了部分脂肪酶活性。這與Zhang等[24]的研究結果相似。

2.3 環己酮對細胞表面疏水性的影響

細胞表面疏水性能夠影響細胞吸收及降解疏水性物質，并影響細胞在界面的黏附性。有機溶劑對多數微生物細胞有破壞作用，迫使細胞表面疏水性下降。環己酮濃度對菌體細胞表面疏水性的結果見圖5。由圖5可知，菌體細胞的表面疏水性隨環己酮濃度和發酵時間出現較大差異。隨著發酵時間的延長，細胞表面疏水性總體呈下降趨勢。其中1%的環己酮中細胞表面疏水性下降得最為明顯。當環己酮濃度逐漸增大，發酵24 h的表面疏水性已由60%降至32%，發酵至120 h時，5% 環己酮中細胞的表面疏水性已降至15%。可見，環己酮對細胞表面疏水性隨濃度增加及發酵時間延長，毒害作用明顯增大。環己酮脅迫下，細胞膜結構發生變化[25]，導致細胞膜疏水性下降，細胞膜的流動性降低，這樣就能減少有機溶劑進入細胞內部，從而減弱有機溶劑對細胞帶來的影響，增強細胞的有機溶劑耐受性。

2.4 環己酮對胞外核苷酸濃度的影響

脫氧核糖核酸（DNA）是微生物體內重要的遺傳物質之一，一般只存在于微生物細胞內部，但在受到各種脅迫下，胞內的遺傳物質會釋放到胞外。環己酮濃度對黑曲霉C2J6胞外核苷酸的影響見圖6，當環己酮濃度為1%時，菌體胞外核苷酸濃度已經達到了70 μg·ml-1左右，但隨著發酵時間的延長其濃度變化不大。在2%～3%環己酮中，胞外核苷酸的濃度隨時間的變化先增加后減小。當環己酮濃度為4%時，發酵24 h后胞外核苷酸的含量已經達到了165 μg·ml-1左右。在5%環己酮中，胞外核苷酸濃度先增加后減小，發酵72 h后，核苷酸濃度呈下降趨勢，但含量還是遠大于發酵48 h的。總體而言，隨著發酵時間的延長和環己酮濃度的增加，黑曲霉C2J6胞外核苷酸濃度呈上升趨勢。說明，環己酮影響了黑曲霉C2J6細胞膜，使得胞內的核苷酸泄漏，從而使胞外核苷酸濃度增加。

2.5 環己酮對細胞膜脂肪酸的影響

2.5.1 環己酮濃度對細胞膜脂肪酸的影響 將C2J6分別在濃度為1%和5%的環己酮下發酵培養72 h，細胞膜脂肪酸變化情況見表2。與不添加環己酮的黑曲霉C2J6細胞膜脂肪酸相比，多不飽和脂肪酸含量隨著環己酮的濃度增加而減少，其中當添加1%環己酮時，亞麻酸、亞油酸和油酸的含量分別降低了4.19%、1.43%和15.71%。當添加5%的環己酮時，亞麻酸、亞油酸和油酸的含量分別降低了6.28%、2.82%和24.22%，其中，油酸含量降低得最多。同時，飽和脂肪酸含量均有不同程度的增加。當添加1%、5%的環己酮時，反式油酸的含量分別增加了15.66%、28.63%。與對照相比，細胞膜脂肪酸的不飽和度降低，5%比1%環己酮下的不飽和度更低。

表2 添加不同濃度環己酮的C2J6脂肪酸的組成

Note: degree of unsaturation/D·mol-1=[1×(monoene%)+2×(diene%)+ 3×(triene%)+4×(tetraene%)]/100.

有文獻報道，細胞膜脂質成分影響細胞膜的運動性和流動性，而細胞膜流動性主要取決于固醇與磷脂的比例及飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸的大小[26-27]。由此推斷，黑曲霉C2J6細胞膜不飽和脂肪酸含量減少，飽和脂肪酸增加，導致細胞膜流動性發生變化，可能是細胞為了抵御有機溶劑的毒害而產生的有利調節。

2.5.2 發酵時間對細胞膜脂肪酸組成的影響 將C2J6在濃度為1%環己酮下發酵培養48 h和72 h，以不添加有機溶劑的發酵培養為對照。由表3可知，黑曲霉在環己酮中培養不同時間時，不飽和脂肪酸的含量均有不同程度的降低。培養48 h，細胞膜中亞麻酸、亞油酸和油酸的含量分別降低了3.79%、1.22%和13.91%。但培養72 h，細胞膜中亞麻酸、亞油酸和油酸的含量分別降低了4.19%、1.43%和15.71%。結合表2，環己酮對黑曲霉C2J6細胞膜的影響，一方面受到環己酮濃度的影響，另一方面也受到發酵時間的影響。隨著發酵時間的延長及環己酮濃度增大，細胞膜不飽和脂肪酸的含量下降較多，脂肪酸飽和度增大。這符合有機溶劑耐受機制的一種HA機制(homeoviscous adaptation)[28-30]，黑曲霉C2J6在增大脂肪酸飽和度的同時，可以抵消有機溶劑造成的流動性，減小對細胞的影響。

表3 在1%環己酮中不同發酵時間下C2J6脂肪酸組成的變化

Note: degree of unsaturation/D·mol-1=[1×(monoene%)+2×(diene%)+ 3×(triene%)+4×(tetraene%)]/100.

3 結 論

（1）黑曲霉C2J6可以在多種有機溶劑中生長產酶，具有廣泛的有機溶劑耐受性。但在不同有機溶劑中生長情況和酶活性有差異。這說明有機溶劑對黑曲霉的毒害不僅與lg值有關，還可能與不同有機溶劑的性質有關。

（2）環己酮使細胞形態發生變化，疏水性降低，胞外核苷酸濃度增加。黑曲霉C2J6通過調節細胞膜脂肪酸組成等改變細胞膜的流動性，從而增強細胞對有機溶劑的耐受性。實驗表明，細胞膜上脂肪酸成分的調節在有機溶劑耐受菌中發揮了重要的作用。

實驗中的不足在于只從細胞水平上研究了環己酮對黑曲霉C2J6的毒害及細胞耐受性機制，未研究細胞對其他有機溶劑的耐受性。今后實驗應對其他有機溶劑的毒害及細胞耐受性機理進行研究，還應該探討細胞結構變化和耐受性間的關系，加強分子水平、基因水平上菌株耐受性機理的研究，以更加全面地詮釋該菌屬對有機溶劑的耐受特性，使此類研究更具有實際應用價值。

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Tolerance mechanism ofC2J6 to cyclohexanone

SU Xuelin1, ZHANG Zihan2, LIU Ya1

(1College of Food Science, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang, China;2Xinjiang Product Quality Supervision and Inspection Institute, Urumqi 830011, Xinjiang, China)

The mycelium growth and enzyme activity ofC2J6 in organic solvent are related to cell tolerance in the solvent. In order to reveal the regulation and mechanism of organic solvent tolerance, fifteen kinds of organic solvents were used to investigate the organic solvent tolerance ofC2J6. Then the tolerance mechanism for cyclohexanone, which is a less hydrophobic solvent, was studied in the cellular level. The results indicate thatC2J6 can grow in a variety of organic solvents for enzyme production. Organic solvents whose lgare between-0.24 and 3.0 will inhibit the cell growth and enzyme production to different degrees, whereas organic solvents whose lgare greater than 3.0 will promote the growth and production. Under the stress of cyclohexanone, the cell membrane is damaged. The intracellular organelles shrunk. The hydrophobicity of cell surface decreased. Extracellular nucleotide concentration increased. The content of unsaturated fatty acid decreased while the content of saturated fatty acid increased. These phenomena illustrate that cellular tolerance to cyclohexanone is influenced in many aspects, and there are variety of tolerance mechanisms working together which help to reduce the toxicity of cyclohexanone on the cells, so as to improve the tolerance of the microbes.

; lipase; organic solvent; cyclohexanone; cell tolerent mechanism

10.11949/j.issn.0438-1157.20170277

Q 93

A

0438—1157（2017）08—3218—07

劉婭，張梓涵。第一作者：蘇雪林（1989—），女，碩士研究生。

國家自然科學基金項目（31460031）。

2017-03-22收到初稿，2017-05-05收到修改稿。

2017-03-22.

Prof. LIU Ya, L68274609@163.com; ZHANG Zihan, musiq0510@sina.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (31460031).