朝鮮龍膽的生藥學(xué)研究

孫紫薇，張 楠，翁麗麗，劉文斌

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.吉林省食品藥品認(rèn)證中心，長(zhǎng)春 130062）

朝鮮龍膽的生藥學(xué)研究

孫紫薇1，張 楠1，翁麗麗1，劉文斌2*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.吉林省食品藥品認(rèn)證中心，長(zhǎng)春 130062）

目的 對(duì)中藥朝鮮龍膽進(jìn)行生藥學(xué)研究，為其品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。方法 依據(jù)《中華人民共和國藥典》中龍膽的研究方法對(duì)朝鮮龍膽進(jìn)行性狀鑒定、顯微鑒定；同時(shí)測(cè)定其水分、灰分、浸出物；采用高效液相色譜法對(duì)其主要化學(xué)成分龍膽苦苷進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果 2個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的朝鮮龍膽根中含水量分別為6.50%及6.42%；水溶性浸出物的含量分別為53.43%及40.84%；灰分含量分別為3.55%及4.10%；龍膽苦苷的含量分別為4.20%及5.40%。結(jié)論 朝鮮龍膽中龍膽苦苷的含量較高，水溶性浸出物的量亦較高，可作為龍膽新資源開發(fā)利用。

朝鮮龍膽；龍膽苦苷；水分；灰分；浸出物

Abstract:?Objective To study on pharmacognosy of Gentiana uchiyamai Nakai, and provide a theoretical basis for its evaluation of quality.Methods Do research of Gentiana uchiyamai Nakai its identification of traits，microscopic and determine the content determination of its moisture, ash and extract according to “Chinese Pharmacopoeia”.Determine the content of the main chemical constituents of gentiopicroside by using HPLC.Results It showed that these two Gentiana uchiyamai Nakai from different areas had different water content from their roots, which were 6.50% and 6.42%, the water soluble extractive were 53.43% and 40.84%, and ash content were 3.55% and 4.10%respectively, the gentian gentiopicroside contents were 4.20% and 5.40%.Conclusion It showed that the content of gentiopicroside and the water soluble extractive content from gentian diamond were high.Gentiana uchiyamai Nakai can be used as a new resource development and utilization of gentian.

Keywords:?Gentiana uchiyamai Nakai; gentiopicroside; moisture; ash; extract

朝鮮龍膽（Gentiana uchiyamai Nakai）為龍膽科植物，又稱金剛龍膽或斑花龍膽[1]，生于林緣草地。耐寒，喜涼爽，忌炎熱；喜濕潤、肥沃的土壤，不耐干旱；喜光，較耐陰[2]。在我國主要分布于黑龍江、吉林、遼寧等地[3]。

現(xiàn)在市場(chǎng)上的龍膽藥材主要是來自西南的滇龍膽和來自東北的關(guān)龍膽[4]。由于各種因素的影響，龍膽的生存環(huán)境不斷遭到破壞、污染，使得龍膽的數(shù)量不斷減少，其在市場(chǎng)上處于供不應(yīng)求的狀態(tài)[5]。同時(shí)龍膽的種類繁多，不同品種龍膽間的質(zhì)量參差不齊。朝鮮龍膽為龍膽同屬植物，在東北地區(qū)具有一定的分布量，其有效化學(xué)成分的含量較高，可作為龍膽的新資源開發(fā)利用，因此對(duì)朝鮮龍膽進(jìn)行生藥學(xué)研究，為其品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀Prominence-ILC-2030，島津企業(yè)管理中國有限公司；電子天平JA2603B(d=0.000 1g)，上海天美天平儀器有限公司；電子天平FA1004B (d=0.000 01g)，上海佑科儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計(jì)TU-1080，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司；恒溫水浴鍋HH-2，江蘇金壇市江南儀器廠；Water Purifier 實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)；電熱鼓風(fēng)干燥箱DHG-9053A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試藥

1.2.1 對(duì)照品 龍膽苦苷（規(guī)格：20 mg，購于中國食品藥品鑒定所）。

1.2.2 試劑 蒽酮、硫酸、乙醇、甲醇均為分析純；色譜甲醇；水為超純水。

1.3 藥材 朝鮮龍膽采集于吉林省白山市八道江區(qū)和吉林省延吉市二道白河鎮(zhèn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 來源鑒定 朝鮮龍膽為多年生草本，莖直立，較粗壯，無毛。基生葉缺，葉對(duì)生，呈披針形，具有3條平行脈，葉兩面均明顯可見，基部無葉柄，頂部漸尖；無花梗，花頂生或上部葉腋；花萼鐘形，花冠呈藍(lán)色或藍(lán)紫色，花冠筒里可見明顯斑點(diǎn)，故而金剛龍膽又稱為斑花龍膽，裂片不整齊，裂片先端鈍圓稍具突尖。雄蕊具有5個(gè)，由黃色花絲和花藥組成，位于冠筒的中央。雌蕊具有1個(gè)，呈棕褐色，子房呈類橢圓形，兩端尖中間寬，柄粗，花柱短。

2.2 性狀鑒定 朝鮮龍膽根莖呈不規(guī)則的塊狀，表面灰棕色至深棕色，上端有殘留莖基或莖痕，周圍及下端有多數(shù)細(xì)長(zhǎng)的根，約為10條。根呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，表面黃棕色或棕色，上端有多數(shù)明顯的橫皺紋，下端較細(xì)，具有縱皺紋和支根痕。質(zhì)脆，易折斷，氣微，味甚苦。

2.3 顯微鑒定

2.3.1 葉表面制片 取朝鮮龍膽葉子1片，分別撕取上、下表皮各1片，置于載玻片上，滴加1～2滴水合氯醛，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。可見上表面表皮細(xì)胞，壁波狀，長(zhǎng)為166～185 μm，寬77～88 μm，細(xì)胞內(nèi)具有圓形油狀物質(zhì)。下表面表皮細(xì)胞有多數(shù)氣孔，副衛(wèi)細(xì)胞數(shù)目不定，為不定式氣孔，氣孔長(zhǎng)27～42 μm，寬16～21 μm；中間氣孔口長(zhǎng)17～21 μm，寬2～6 μm。可見明顯的導(dǎo)管及圓形油狀物質(zhì)。

2.3.2 花粉粒制片 取花粉少許，于載玻片上，滴加1～2滴水合氯醛，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。可見多數(shù)呈類圓形的花粉粒，壁上有短刺，直徑75～85 μm。

2.3.3 根粉末制片 取朝鮮龍膽根粉末少許，于載玻片上滴加1～2滴水合氯醛，蓋上蓋玻片，制片完成，置于顯微鏡下觀察。可見內(nèi)皮層細(xì)胞表面觀呈類長(zhǎng)方形，極大，長(zhǎng)106～192 μm，寬63～141 μm，具有明顯橫隔壁將細(xì)胞分成若干個(gè)子細(xì)胞，每個(gè)子細(xì)胞被縱隔壁分成2～4個(gè)小細(xì)胞。外皮層細(xì)胞表面觀呈紡錘形，長(zhǎng)121～187 μm，每一個(gè)細(xì)胞被橫隔壁分成若干個(gè)類長(zhǎng)方形的子細(xì)胞。導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管或網(wǎng)紋導(dǎo)管，直徑18～63 μm。草酸鈣針晶較多，長(zhǎng)21～25 μm。

2.4 水分測(cè)定 依照2015版《中華人民共和國藥典》[6]第4部通則（0832第2法水分測(cè)定法）測(cè)定水分含量。取粉末約2 g，置于稱量瓶中，105 ℃干燥5 h，于干燥器中冷卻，并在上述溫度下再干燥1 h，冷卻，稱重至恒重。以減失的重量為依據(jù)，計(jì)算含量（%），即得。

結(jié)果吉林省白山市八道江區(qū)的朝鮮龍膽水分含量為6.50%，吉林省延吉市二道白河的朝鮮龍膽水分含量為6.42%。

2.5 浸出物測(cè)定 依照2015版《中華人民共和國藥典》第4部通則（2201浸出物測(cè)定法熱浸法）取供試品大約2 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加水100 mL，密塞，稱重，靜置1 h后，回流提取1 h，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，置于蒸發(fā)皿中蒸干，105 ℃干燥3 h，冷卻30 min，稱重，計(jì)算即得。

結(jié)果吉林省白山市八道江區(qū)的朝鮮龍膽浸出物量為53.43%，吉林省延吉市二道白河的朝鮮龍膽浸出物量為40.84%。

2.6 灰分測(cè)定 依照2015版《中華人民共和國藥典》第4部通則（2302總灰分測(cè)定法）取粉末約2 g，置于坩堝內(nèi)，稱重，加熱至完全碳化，置馬弗爐中灰化。根據(jù)殘?jiān)亓坑?jì)算含量（%），即得。

結(jié)果吉林省白山市八道江區(qū)的朝鮮龍膽灰分含量為3.55%，吉林省延吉市二道白河的朝鮮龍膽灰分含量為4.10%。

2.7 朝鮮龍膽中龍膽苦苷的含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件 色譜柱為：Agilent Innoval C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水（25：75）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

2.7.2 對(duì)照品溶液的制備 取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱重，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.7.3 供試品溶液的制備 取朝鮮龍膽粉末約0.5 g，精密稱重，置于50 mL的具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，精密稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）15 min，稱重，用甲醇補(bǔ)充減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.7.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取龍膽苦苷對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣 2、4、6、8、10、12、16 μL，按照上述的色譜條件測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以龍膽苦苷含量為橫坐標(biāo)X，縱坐標(biāo)Y為相應(yīng)的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=1 701 193.02 X+4 737.35，相關(guān)系數(shù)r =0.999 9。結(jié)果表明，對(duì)照品在0.4～3.2 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7.5 精密度試驗(yàn) 吸取同一“2.7.3”項(xiàng)下朝鮮龍膽供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL記錄峰面積，其值依次為：3 615 458、3 652 645、3 556 751、3 562 106、3 566 679、3 591 035，結(jié)果RSD=1.42%，表明儀器具有良好的精密度。

2.7.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取朝鮮龍膽樣品按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，依次進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算龍膽苦苷的含量，其值依次為：4.20%、4.19%、4.21%、4.22%、4.22%、4.20%，結(jié)果RSD=0.80%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一朝鮮龍膽供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、12、24 h依法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，其值依次為：3 617 247、3 556 102、3 569 948、3 557 937、3 553 484、3 596 530、3 575 207，結(jié)果RSD=0.73%，表明供試品溶液中的龍膽苦苷在24 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.8 加樣回收率試驗(yàn) 取朝鮮龍膽樣品6份，精密稱定，加入適量的龍膽苦苷對(duì)照品，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備，測(cè)定龍膽苦苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.79%，RSD值為0.33%。

2.7.9 樣品含量測(cè)定 分別取不同地區(qū)朝鮮龍膽不同部位的粉末，按上述供試品溶液的制備方法和色譜條件測(cè)定龍膽苦苷含量，結(jié)果見表1。

表1 朝鮮龍膽中龍膽苦苷含量測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)以及《中華人民共和國藥典》[6]中關(guān)于同屬龍膽的生藥學(xué)的研究方法，對(duì)朝鮮龍膽分別進(jìn)行了來源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定，并分別對(duì)水分、灰分、浸出物進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)測(cè)定了朝鮮龍膽中主要有效化學(xué)成分龍膽苦苷。

結(jié)果表明，朝鮮龍膽中平均水分含量為6.46%，平均水溶性浸出物的含量為47.14%，平均灰分含量為3.83%，朝鮮龍膽根中龍膽苦苷的平均含量為4.80%，莖葉中平均含量為0.55%，花中平均含量為0.88%，回收率為99.79%。含量測(cè)定結(jié)果表明，朝鮮龍膽根中龍膽苦苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莖葉和花，實(shí)驗(yàn)儀器的精密度符合要求，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均良好。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)朝鮮龍膽的生藥學(xué)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，朝鮮龍膽中具有一定量的龍膽苦苷，同時(shí)水溶性浸出物也較高。吉林省朝鮮龍膽具有一定的資源分布量，具有潛在的開發(fā)價(jià)值，可作為龍膽的新資源開發(fā)利用。

[1]具誠.高瑋,王魁頤.吉林省生物種類與分布[M].長(zhǎng)春：東北師范大學(xué)出版社, 1997： 233.

[2]劉延江.新編園林觀賞花卉[M].沈陽： 遼寧科學(xué)技術(shù)出版社 , 2007： 544.

[3]曹偉, 李翼云.小興安嶺植物區(qū)系與分布[M].北京： 科學(xué)出版社 , 2007： 204.

[4]吳立宏.中藥龍膽的應(yīng)用傳承[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化 , 2011, 13(2)： 340-347.

[5]沈濤, 金航, 王元忠, 等.中藥龍膽化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(30)： 16868-16870, 16874.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2015： 96.

Study on pharmacognosy of Gentiana uchiyamai Nakai

SUN Ziwei1, ZHANG Nan1, WENG Lili1, LIU Wenbin2*
（1.Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China；2.Jilin Certification Center for Food and Drug, Changchun 130062, China）

R932

A

2095-6258(2017)05-0720-03

2017-01-05）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.011

吉林省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2014-ZDB）。

孫紫薇（1994 -），女，碩士研究生，主要從事中藥學(xué)研究。

*通信作者：劉文斌，男， 助理研究員，電話-13504315728， 電子信箱-525055921@qq.com