兒童患者下呼吸道標(biāo)本苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率的影響因素分析

潘 芬， 趙婉彤， 張?zhí)鞐潱?石迎迎， 蔣 婕， 張 泓

兒童患者下呼吸道標(biāo)本苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率的影響因素分析

潘 芬， 趙婉彤， 張?zhí)鞐潱?石迎迎， 蔣 婕， 張 泓

目的分析兒童患者下呼吸道標(biāo)本苛養(yǎng)菌（肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌）陽(yáng)性分離率的影響因素。方法選取210份下呼吸道標(biāo)本，分別在采集后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h接種于血平皿和巧克力平皿，研究運(yùn)送時(shí)間、運(yùn)送培養(yǎng)基和不同接種培養(yǎng)基對(duì)苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率的影響。結(jié)果200份合格下呼吸道標(biāo)本研究結(jié)果顯示：隨著標(biāo)本放置時(shí)間的增加，肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌陽(yáng)性分離率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，除0.5 h、2 h時(shí)間段外結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但0.5 h、2 h 2個(gè)時(shí)間段樣本陽(yáng)性率無(wú)差異；含半固體培養(yǎng)基的陽(yáng)性分離率在不同時(shí)間段均高于其他2種運(yùn)送培養(yǎng)基，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌在兩種商品化平皿中陽(yáng)性分離率、生長(zhǎng)情況差別不大（P＞0.05）。結(jié)論選擇合適的運(yùn)送時(shí)間、運(yùn)送培養(yǎng)基和接種培養(yǎng)基對(duì)于提高苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率具有一定的意義。

下呼吸道； 苛養(yǎng)菌； 陽(yáng)性分離率

Abstract: ObjectiveTo investigate the factors affecting the isolation of fastidious bacteria such asStreptococcus pneumoniaeandHaemophilus in fl uenzaefrom lower respiratory tract specimens in children.MethodsA total of 210 lower respiratory tract specimens from children were collected and inoculated on both blood agar plate and chocolate agar plate 0.5 h, 2 h, 6 h, 12 h,and 24 h after collection. The effect of specimen turnaround time, transport medium, and inoculation medium on the isolation of fastidious bacteria was studied.ResultsThe results of 200 quali fi ed specimens showed that the isolation ofS. pneumoniaeandH. in fl uenzaesigni fi cantly decreased with the increasing of specimen turnaround time (P＜0.05), but no signi fi cant difference was observed between 0.5 h and 2 h timepoints. The isolation of fastidious bacteria in semi-solid medium was non-signi fi cantly higher than the other two transport medium (P＞0.05). No signi fi cant difference was found in the isolation and growth ofS. pneumoniaeandH. in fl uenzaeon different inoculation media (P＞0.05).ConclusionsThe appropriate specimen turnaround time, transport medium,and inoculation medium are important for improving the isolation of fastidious bacteria from lower respiratory tract in children.

Key words:lower respiratory tract; fastidious bacterium; isolation

肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌是引起下呼吸道感染（low respiratory tract infections， LRTI）的常見(jiàn)苛養(yǎng)菌，陽(yáng)性分離率為20%～60%[1-3]。下呼吸道標(biāo)本病原菌的分離和鑒定是診斷下呼吸道感染的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。及時(shí)快速有效分離苛養(yǎng)菌是治療LRTI的主要措施之一。

由于各實(shí)驗(yàn)室的人員和技術(shù)的差異，引起不同醫(yī)院之間報(bào)道的LRTI苛氧菌陽(yáng)性分離率高低不同[5-6]，從而影響了肺部感染病原菌的診斷，造成抗菌藥物的不合理使用，延遲了臨床上患兒的治療時(shí)機(jī)。基于本實(shí)驗(yàn)室較高的苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率，本研究將對(duì)下呼吸道標(biāo)本流程所涉及的技術(shù)要素進(jìn)行評(píng)估，分別從標(biāo)本分析前、分析中進(jìn)行逐步規(guī)范化分析，建立并評(píng)估下呼吸道苛養(yǎng)菌分離的規(guī)范流程，以期提高下呼吸道標(biāo)本的采集合格率、及時(shí)送檢率及苛養(yǎng)菌準(zhǔn)確分離率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對(duì)象 收集我院2016年10－12月210例疑似下呼吸道感染患兒的下呼吸道標(biāo)本210份。

1.1.2試劑與儀器 無(wú)菌棉拭子、常規(guī)三通管、含半固體培養(yǎng)基運(yùn)送培養(yǎng)基、血平皿（上海伊華生物有限公司、Thermo生物有限公司）、含萬(wàn)古霉素的巧克力平皿（上海伊華生物有限公司、Thermo生物有限公司）、肺炎鏈球菌臨床菌株、流感嗜血桿菌臨床菌株、質(zhì)控菌株（肺炎鏈球菌ATCC49619和流感嗜血桿菌ATCC49766）、一次性100 μL定量接種環(huán)（上海遠(yuǎn)慕生物有限公司）、VITEK 2-Compact自動(dòng)鑒定儀（法國(guó)梅里埃生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1下呼吸道標(biāo)本采集 臨床微生物操作人員采用氣管插管結(jié)合負(fù)壓吸引方法[7]對(duì)210例患兒進(jìn)行痰液標(biāo)本采集，采集過(guò)程均嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行，每份標(biāo)本均置于無(wú)菌棉拭子、常規(guī)三通管、含半固體培養(yǎng)基運(yùn)送培養(yǎng)基。

1.2.2分析前評(píng)估（評(píng)估下呼吸道標(biāo)本數(shù)210份）

1.2.2.1標(biāo)本質(zhì)量判斷[8]① 肉眼觀察下呼吸道標(biāo)本，標(biāo)本形態(tài)：“水狀”、“黏液狀”、“膿性”、“含血絲”、“全為血狀”，記錄標(biāo)本性狀；② 涂片鏡檢：低倍顯微鏡下，痰液涂片白細(xì)胞＞25個(gè)，上皮細(xì)胞＜10個(gè)，為合格標(biāo)本；③ 計(jì)算送檢下呼吸道標(biāo)本的合格率：合格率=合格標(biāo)本數(shù)/送檢標(biāo)本總數(shù)；

1.2.2.2評(píng)估標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間、運(yùn)送培養(yǎng)基對(duì)苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率的影響 ① 將無(wú)菌棉拭子、常規(guī)三通管、含半固體培養(yǎng)基運(yùn)送培養(yǎng)基的每份痰液標(biāo)本，分別于采集后0.5、2、6、12和24 h接種于不同血平皿和巧克力培養(yǎng)基中；②將接種的平皿置于37 ℃，5% CO2條件下，孵育18～24 h，觀察菌落形態(tài)，對(duì)疑似為苛養(yǎng)菌菌落（肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌）進(jìn)行純分，純分后的菌落經(jīng)VITEK 2-Compact自動(dòng)鑒定儀鑒定，確定菌種；③ 最后計(jì)算下呼吸道標(biāo)本苛養(yǎng)菌陽(yáng)性檢出率：苛養(yǎng)菌檢出率=標(biāo)本苛養(yǎng)菌陽(yáng)性數(shù)/合格標(biāo)本數(shù)，評(píng)價(jià)標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間、運(yùn)送培養(yǎng)基對(duì)苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率的影響。

1.2.3分析中評(píng)估（評(píng)估上述肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌在不同商品化培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況）① 分別選擇2種商品化培養(yǎng)基（肺炎鏈球菌用血平皿、流感嗜血桿菌用巧克力平皿）；② 將下呼吸道標(biāo)本分離陽(yáng)性菌株配置成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海ㄏ喈?dāng)于1.5×108cfu/mL），在0、24、48 h 3個(gè)時(shí)間段分別準(zhǔn)備1支含半固體培養(yǎng)基塑料管，用微量加樣槍吸取10 μL菌懸液加入各拭子中。將24、48 h的拭子插入配備的含有半固體培養(yǎng)基的塑料管中，使拭子完全包含在半固體培養(yǎng)基的內(nèi)部，置于室溫；③將0 h的各拭子立即放入裝有1 mL無(wú)菌0.9%NaCl溶液的試管中，漩渦振蕩30 s，在管壁上盡量擠干拭子，丟棄拭子。吸取100 μL洗脫液加入裝有0.9% NaCl溶液0.9 mL的試管中，做5個(gè)10倍濃度稀釋；④每個(gè)稀釋度取100 μL液體加入相應(yīng)的培養(yǎng)皿表面，均勻涂抹，置于37 ℃，5% CO2條件下，培養(yǎng)24～48 h；⑤ 取菌落數(shù)在30～300個(gè)的培養(yǎng)皿作菌落計(jì)數(shù)，算出每個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)，從而計(jì)算出0、24、48 h 3個(gè)時(shí)間段各細(xì)菌的平均菌落數(shù)，以0 h的平均菌落數(shù)為100%帶菌量，算出24、48 h各菌種的存活百分率；⑥ 在選中的培養(yǎng)皿中分別選出最大的5個(gè)單個(gè)菌落，用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量最大菌落的直徑，并統(tǒng)計(jì)平均菌落的直徑；⑦ 對(duì)2種商品化血平皿中肺炎鏈球菌α 溶血的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)；⑧質(zhì)控：測(cè)定過(guò)程中所有操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制文件進(jìn)行。試驗(yàn)開始前，按照說(shuō)明書選擇相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株。對(duì)2種商品化血平皿進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)量可控才可將測(cè)定數(shù)據(jù)納入研究。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用行×列卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析前評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1標(biāo)本合格情況 本實(shí)驗(yàn)共采集了210份痰液標(biāo)本，根據(jù)標(biāo)本性狀，可分為“水狀”10份、“黏液狀”112份、“膿性”70份、“含血絲”18份；顯微鏡鏡檢合格標(biāo)本有200份，標(biāo)本合格率達(dá)95.2%。200份合格痰液標(biāo)本中，共檢測(cè)到肺炎鏈球菌78株，流感嗜血桿菌30株，其中5份標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)出肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌。

2.1.2運(yùn)送時(shí)間對(duì)苛養(yǎng)菌陽(yáng)性檢出率的影響 200份合格痰液標(biāo)本在0.5 h、2 h、6 h、12 h和24 h 5個(gè)時(shí)間段的肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌陽(yáng)性分離率見(jiàn)表1、表2，結(jié)果表明隨著標(biāo)本放置時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌菌落數(shù)量不斷減少（4+→1+/-），陽(yáng)性分離率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但0.5 h、2 h兩個(gè)時(shí)間段標(biāo)本陽(yáng)性率并無(wú)差異。

2.1.3運(yùn)送培養(yǎng)基對(duì)苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率的影響 200份合格痰液標(biāo)本在3種運(yùn)送培養(yǎng)基（無(wú)菌棉拭子、常規(guī)三通管和含半固體運(yùn)送培養(yǎng)基）的肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌陽(yáng)性分離率見(jiàn)表1、表2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含半固體培養(yǎng)基的陽(yáng)性分離率在不同時(shí)間段均高于其他2種運(yùn)送培養(yǎng)基，然結(jié)果差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是，為保證2種苛養(yǎng)菌的陽(yáng)性分離率，建議可常規(guī)采用含半固體運(yùn)送培養(yǎng)基，尤其在標(biāo)本未能及時(shí)接種的情況下。

表1 標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間和運(yùn)送培養(yǎng)基對(duì)肺炎鏈球菌陽(yáng)性分離率的影響Table 1 The effect of specimen turnaround time and transport medium on isolation ofStreptococcus pneumoniaefrom lower respiratory tract

表2 標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間和運(yùn)送培養(yǎng)基對(duì)流感嗜血桿菌陽(yáng)性分離率的影響Table 2 The effect of specimen turnaround time and transport medium on isolation ofHaemophilus in fl uenzaefrom lower respiratory tract

2.2 分析中評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1不同培養(yǎng)基對(duì)苛養(yǎng)菌檢出率的影響 在不同時(shí)間段，肺炎鏈球菌在2種商品化血平皿中陽(yáng)性分離率差別不大（P＞0.05），同時(shí)流感嗜血桿菌在不同商品化巧克力平皿上檢出率也并無(wú)明顯差異（P＞0.05），提示肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌在不同廠家的血平皿、巧克力平皿陽(yáng)性分離率均較為相似，不同廠家血平皿和巧克力平皿對(duì)2種苛養(yǎng)

菌的陽(yáng)性分離率影響較小。見(jiàn)表1、表2。

2.2.2不同培養(yǎng)基對(duì)苛養(yǎng)菌生長(zhǎng)情況的影響 肺炎鏈球菌在不同培養(yǎng)基的菌落大小存在一定差異；在菌落數(shù)量、細(xì)菌存活率和溶血性能方面差異不大；而流感嗜血桿菌不同培養(yǎng)基的菌落數(shù)量、大小、細(xì)菌存活率方面并無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌生長(zhǎng)情況的影響Table 3 Effect of different inoculation media on the growth ofStreptococcus pneumoniaeandHaemophilus in fl uenzae

3 討論

合格的下呼吸道標(biāo)本是診斷下呼吸道感染的重要前提之一，臨床常規(guī)采用的取材方法有咯痰法、負(fù)壓吸痰法、支氣管肺泡灌洗液取材等方法[7，9]，由于兒童人群無(wú)法自主咯痰，且經(jīng)口咯痰易被口腔定植菌污染，其可靠性及敏感性均不如其他方法；支氣管鏡肺泡灌洗液有一定的指征，雖能提高病原菌的檢出率，但操作較負(fù)壓吸痰法為煩瑣，因此臨床一般建議采用負(fù)壓吸痰法以獲得下呼吸道標(biāo)本。

影響LRTI細(xì)菌檢出率的主要因素包括實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)操作、標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間、運(yùn)送培養(yǎng)基、培養(yǎng)平皿的選擇等。本研究針對(duì)分析前影響因素進(jìn)行分析：①實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員操作。本研究均采用統(tǒng)一化培訓(xùn)方式，遵循實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程，并由同一名微生物檢驗(yàn)人員操作，減少人員之間的差異性，以確保下呼吸道標(biāo)本的合格率，保證苛養(yǎng)菌的分離。②標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著運(yùn)送時(shí)間的增加，苛養(yǎng)菌（肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌）檢出率逐漸減低，這提示下呼吸道標(biāo)本需在標(biāo)本采集后2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室并完成接種；若2 h內(nèi)無(wú)法完成接種，建議冰箱保存6 h，否則會(huì)影響苛養(yǎng)菌的檢出率。③標(biāo)本運(yùn)送培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)采用的3種運(yùn)送培養(yǎng)基進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)含半固體培養(yǎng)基的運(yùn)送系統(tǒng)檢出率明顯高于其他運(yùn)送管，有研究數(shù)據(jù)表明含半固體培養(yǎng)基的運(yùn)送系統(tǒng)由1支無(wú)菌纖維拭子和含有能維持細(xì)菌生物活性的半固體培養(yǎng)基的塑料管組成，培養(yǎng)基能為插入其中的標(biāo)本提供氧分和水分，防止標(biāo)本干燥，保證標(biāo)本中的細(xì)菌存活[10]。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求不高的細(xì)菌，還起到增殖作用，使標(biāo)本能夠較長(zhǎng)時(shí)間保存。

此外，除了分析前的幾個(gè)因素外，分析中的因素對(duì)于苛養(yǎng)菌的分離培養(yǎng)也起到一定的作用。分析中影響因素包括：①培養(yǎng)平皿的選擇。肺炎鏈球菌一般采用哥倫比亞血瓊脂平皿分離。由于流感嗜血桿菌營(yíng)養(yǎng)條件要求較高，一般采用巧克力平皿進(jìn)行分離。②苛養(yǎng)菌的典型形態(tài)。不同來(lái)源的同一瓊脂平皿，由于其營(yíng)養(yǎng)成分含量不同，使得細(xì)菌形態(tài)存在一定的差異。典型肺炎鏈球菌菌落形態(tài)呈現(xiàn)小、濕潤(rùn)、隆起、灰白色、草綠色溶血，注意與鏈球菌屬其他細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分，以免遺漏，影響細(xì)菌陽(yáng)性分離率。典型流感嗜血桿菌菌落形態(tài)呈無(wú)色透明、不溶血、呈露滴狀小菌落，注意與奈瑟菌鑒別。③實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員的檢測(cè)能力。實(shí)驗(yàn)室操作人員均具有微生物多年檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，能確保上述苛養(yǎng)菌的準(zhǔn)確分離及鑒定。本研究結(jié)果顯示2種商品化培養(yǎng)基的苛養(yǎng)菌陽(yáng)性分離率差別不大（P＞0.05），但是由于培養(yǎng)基含水量的不同，使得菌落大小存在一定的差異，這就需要考驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)水平。在苛養(yǎng)菌菌株分離過(guò)程中，需結(jié)合其他生化試驗(yàn)輔助鑒定該菌株，以防漏檢。

因此，在下呼吸道標(biāo)本采集、分離培養(yǎng)及鑒定的過(guò)程中，做好分析前、分析中兩大方面的規(guī)范操作，確保標(biāo)本準(zhǔn)備采集、及時(shí)接種和準(zhǔn)確鑒定，對(duì)于提高苛養(yǎng)菌的檢出率具有一定的意義，為臨床上有效治療兒童下呼吸道苛養(yǎng)菌感染提供有力支持，進(jìn)而降低兒童下呼吸道苛養(yǎng)菌的感染率。

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Factors affecting the isolation of fastidious bacteria from lower respiratory tract specimens in children

PAN Fen, ZHAO Wantong, ZHANG Tiandong, SHI Yingying, JIANG Jie, ZHANG Hong. （Department of Laboratory Medicine, Shanghai Children's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040, China）

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0541-05

10.16718/j.1009-7708.2017.05.011

2017-03-03

2017-03-30

上海申康醫(yī)院發(fā)展中心市級(jí)醫(yī)院臨床輔助科室能力建設(shè)項(xiàng)目（SHDC22014012）；上海市衛(wèi)計(jì)委重要薄弱學(xué)科建設(shè)（2015ZB0203）。

上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040。

潘芬（1988—），女，碩士，檢驗(yàn)技師，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制及傳播機(jī)制研究。

張泓，E-mail：zhanghong3010@126.com。