MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定陽性血培養(yǎng)病原菌的應(yīng)用評估

秦娟秀， 黃 芊， 高倩倩， 謝乙慧， 李 敏， 張灝旻

MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定陽性血培養(yǎng)病原菌的應(yīng)用評估

秦娟秀， 黃 芊， 高倩倩， 謝乙慧， 李 敏， 張灝旻

目的比較MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix- assisted laser desorption ionization- time of fl ight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)直接鑒定血培養(yǎng)陽性病原菌的有效性。方法收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院2016年4－6月血培養(yǎng)儀報(bào)警的非重復(fù)血培養(yǎng)瓶138個(gè)，以傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定的方法為金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)采用以上兩種前處理方法處理陽性標(biāo)本，再進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定。結(jié)果本次共收集非重復(fù)的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本138份，排除6個(gè)假陽性血瓶，鑒定出的病原菌包括革蘭陰性菌70株（53.03%）、革蘭陽性菌57株（43.18%）、真菌3株和2例復(fù)數(shù)菌。MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法的血培養(yǎng)快速鑒定病原菌準(zhǔn)確率分別為91.67%和84.09%，種鑒定準(zhǔn)確率分別為83.33%和61.36%。兩種前處理方法處理后，革蘭陰性菌的準(zhǔn)確率分別為98.57%和 95.71%，革蘭陽性菌的準(zhǔn)確率分別為87.72%和78.59%，兩者鑒定所需時(shí)間為40 min/樣本和25 min/樣本。結(jié)論雖然MALDI SepsityperTMKit 比血清分離膠促凝管法鑒定準(zhǔn)確率稍高但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（91.67%對84.09%，P＞0.05），與MALDI SepsityperTMKit相比，血清分離膠促凝管法是一種快速、易獲得、低廉的MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)病原菌的前處理方法。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜； MALDI SepsityperTMKit； 血清分離膠促凝管法； 血培養(yǎng)； 病原菌

Abstract: ObjectiveThe aim of this study was to evaluate the commercial Sepsityper? kit and serum separator tube coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for direct identification of microorganisms in a blood culture system.MethodsA total of 138 clinical blood samples from clinical laboratory in Renji hospital were tested with two methods respectively from April to June of 2016. Performance of the assays were compared against that of conventional bacterial culture as a reference.ResultsA total of 138 nonduplicate positive blood culture samples were collected,including 70 (53.03%) gram negative samples, 57 (43.18%) gram positive samples, 3 fungus samples, 2 mixed samples, and 6 false positive samples which were excluded from further analysis. The accuracy rate of Sepsityper? kit and serum separator tube was 91.67% and 84.09% in rapid identification of pathogen from blood samples, 83.33% and 61.36% in correct identification to species level. The accuracy rate of Sepsityper? kit and serum separator tube was 98.57% and 95.71% in identifying gram-negative bacteria, 87.72% and 78.59% in identifying gram-positive bacteria, respectively. The turnaroundtime for identification of each sample was 40 min by the commercial Sepsityper? kit and 25 min by serum separator tube.ConclusionsMALDI SepsityperTMkit has shown slightly higher accuracy rate in identi fi cation of pathogen from blood sample than serum separator tube, but the difference is not signi fi cant (91.67% vs. 84.09%,P＞0.05). Compared with MALDI SepsityperTMkit,serum separator tube is a rapid, easy, and cost-effective pretreatment method for direct identi fi cation of microorganisms from blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry.

Key words:matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry; MALDI Sepsityper? Kit; serum separator tube as pretreatment methods; blood culture; pathogen

血流感染是臨床非常危重的感染類型，有較高的發(fā)病率和致死率。據(jù)估計(jì)，全球范圍內(nèi)每年約1 900萬人發(fā)生膿毒血癥[1]。依據(jù)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)，2012年我國血流感染分離菌株數(shù)較2011年增加了21.4%[2]。傳統(tǒng)的微生物鑒定方法主要是基于表型的檢測，包括革蘭染色，微生物培養(yǎng)和生化試驗(yàn)等，往往耗時(shí)較長，需要至少72 h才能將結(jié)果反饋臨床。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix- assisted laser desorption ionization- time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年發(fā)展起來的一種新型的細(xì)菌鑒定技術(shù)，不僅可以快速準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌，還可用于一些無菌樣本如血液和尿液的直接鑒定，極大地縮短了檢測時(shí)間[3-5]。而MALDI-TOF MS直接鑒定血液和無菌體液是否準(zhǔn)確取決于樣品的前處理。MALDI SepsityperTMKit是德國布魯克公司推出專門用于血培養(yǎng)直接鑒定的前處理試劑盒，同時(shí)與本實(shí)驗(yàn)室采用的血清分離膠促凝管法進(jìn)行比較，并以傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法作為參考方法，來評估兩種方法快速鑒定血培養(yǎng)陽性的有效性，從而找出適合不同實(shí)驗(yàn)室的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 收集2016年4－6月上海仁濟(jì)醫(yī)院第1次培養(yǎng)陽性的血培養(yǎng)瓶進(jìn)行研究。

1.1.2儀器與試劑 MALDI-TOF MS、MALDI SepsityperTMKit和α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)（HCCA）購自德國Bruker Daltonik公司；BACTECTM FX 血培養(yǎng)系統(tǒng)、 血清分離膠促凝管、需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶購自美國BD公司；甲酸、無水乙醇和乙腈購自美國Sigma-Aldrich公司；VITEK 2-Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)和鑒定板條購自法國生物梅里埃公司；需氧血平皿、厭氧血平皿、麥康凱平皿和巧克力平皿購自英國OXIOD公司。

1.2 方法

1.2.1血培養(yǎng)陽性 直接革蘭染色涂片鏡檢培養(yǎng)陽性，取出陽性瓶，記錄陽性時(shí)間，并將陽性瓶中抽取部分液體涂片后進(jìn)行革蘭染色，記錄血培養(yǎng)瓶中待測菌的種類及革蘭染色分類。

1.2.2傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定法 根據(jù)涂片結(jié)果，將陽性標(biāo)本轉(zhuǎn)種相應(yīng)培養(yǎng)基，并-80 ℃保存。試驗(yàn)菌株從冰箱取出劃線接種于哥倫比亞羊血瓊脂平皿上， 37°C 培養(yǎng) 18～24 h， 生長成單個(gè)菌落用無菌槍頭挑取單個(gè)菌落均勻涂抹在靶板上，每孔加70%甲酸1 μL，待晾干后每孔加基質(zhì)液1 μL，采用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定。

1.2.3MALDI SepsityperTMKit方法 參考該試劑盒說明書進(jìn)行操作，蛋白提取后，輸入菌株信息，采集菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用軟件Biotyper 3.0將人工采集到的圖譜與數(shù)據(jù)庫中的圖譜進(jìn)行比對和結(jié)果分析，鑒定菌種，記錄質(zhì)譜評分前2種非重復(fù)菌種的鑒定結(jié)果。

1.2.4血清分離膠促凝管法 直接鑒定方法將500 μL無菌水加入到1.5 mL的離心管中備用；消毒陽性瓶口，抽取混勻的5 mL血培養(yǎng)瓶內(nèi)容物至BD分離膠促凝管，3 000 r/min離心10 min。用1 μL一次性接種環(huán)挑取上述步驟得到的灰白色菌體富集物加入到無菌水500 μL中，13 000 r/min，離心2 min；用無菌吸管吸取上清液棄去，加入無菌水500 μL懸浮并充分振蕩混勻，13 000 r/min，離心2 min；重復(fù)上一步驟；棄去上清液，加入無水乙醇700 μL懸浮并震蕩混勻，13 000 r/min，離心2 min；用移液槍將上清液（乙醇）吸取并棄去，13 000 r/min，離心2 min；室溫開蓋放置數(shù)分鐘晾干去除乙醇（殘留的乙醇會影響質(zhì)譜峰，故盡量完全干燥）；向晾干的離心管中加入70%甲酸30 μL震蕩混勻，再加入乙腈30 μL，13 000 r/ min，離心2 min；取離心后的上清液1 μL點(diǎn)樣至金屬靶板并室溫晾干。待干燥后加入基質(zhì)液1 μL，輸入菌株信息，采集菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用軟件Biotyper3.0將人工采集到的圖譜與數(shù)據(jù)庫中的圖譜進(jìn)行比對和結(jié)果分析，鑒定菌種，記錄質(zhì)譜評分前 2 種非重復(fù)菌種的鑒定結(jié)果。

1.2.5基因測序法 對于兩種前處理方法導(dǎo)致的質(zhì)譜鑒定結(jié)果與純菌落質(zhì)譜結(jié)果不相符的菌株采用16S rRNA測序法進(jìn)行最終確認(rèn)。采用天根生化試劑盒提取細(xì)菌DNA，提取的DNA作為模板待用。細(xì)菌鑒定采用16 S rRNA 序列測定法進(jìn)行分子鑒定（引物：F， 5'-AGAGTTTGATGATGGCTCAG-3'；R， 5'-ACCGCAACTGCTGGCAC-3'）真菌采用 18 S rRNA序列測定法進(jìn)行分子鑒定（引物：F， 5'-GATACCGTCGTAGTCTTA-3'；R， 5'-ATTCCTCGTT GAAGAGC-3'），PCR 擴(kuò)增條件為 ：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32 個(gè)循環(huán) ；72 ℃延伸 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序，所得序列在NCBI進(jìn)行比對。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 根據(jù)MALDI-TOF MS鑒定軟件設(shè)置的鑒定Cutoff值標(biāo)準(zhǔn)，對于純分單個(gè)菌落，得分在2.0以上完全可以鑒定到種的水平；得分在1.7～2.0，可能鑒定到屬水平；得分1.7以下，鑒定不準(zhǔn)確。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，我們選取了修正Cutoff值來評估兩種方法的有效性，修正Cutoff-2值標(biāo)準(zhǔn)為≥1.8鑒定到“種”水平，介于1.8～1.6鑒定到“屬”水平，得分1.6以下結(jié)果不可信。同時(shí)參考本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出修正Cutoff-3值標(biāo)準(zhǔn)：≥1.8鑒定到“種”水平，介于1.8～1.6鑒定到“屬”水平，如果得分≤1.6，但鑒定結(jié)果前3位均屬于同一種菌也認(rèn)為鑒定正確，否則鑒定不可靠。兩種方法鑒定正確率的比較采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種前處理方法總準(zhǔn)確率比較

本次共收集非重復(fù)的血培養(yǎng)陽性標(biāo)本138份，排除6個(gè)假陽性血瓶，鑒定出的病原菌包括革蘭陰性菌 70株（53.03%）、革蘭陽性菌 57 株（43.18%） 、真菌3株和2例復(fù)數(shù)菌。按照經(jīng)典Cutoff值 即Cutoff-1標(biāo) 準(zhǔn)：MALDI SepsityperTMKit 和分離膠促凝管兩種前處理方法對血培養(yǎng)快速鑒定病原菌準(zhǔn)確率分別為87.88%和71.97%，種鑒定準(zhǔn)確率分別為68.18%和43.18%；屬鑒定的準(zhǔn)確率（排除種鑒定準(zhǔn)確的標(biāo)本，以下均按該方法計(jì)算）為19.70%和28.79%；未鑒定率分別為12.12%和28.03%。MALDI SepsityperTMKit鑒 定的準(zhǔn)確率略高于血清分離膠促凝管法，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（87.88% 對71.97%，P＞0.05）。按照修正的Cutoff-2標(biāo)準(zhǔn)，MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法對血培養(yǎng)快速鑒定病原菌準(zhǔn)確率分別為90.15%和76.52%；種鑒定準(zhǔn)確率分別為83.33%和61.36%；屬鑒定的準(zhǔn)確率為6.82%和15.15%；未鑒定率分別為9.85%和23.48%。在該水平上，MALDI SepsityperTMKit 與血清分離膠促凝管法相比有較高的準(zhǔn)確率，差異同樣無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（95.45%對76.52%，P＞0.05）。按照修正的Cutoff-3標(biāo)準(zhǔn)MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法對血培養(yǎng)快速鑒定病原菌準(zhǔn)確率分別為91.67%和84.09%；種鑒定準(zhǔn)確率分別為83.33%和61.36%，與Cutoff-2標(biāo)準(zhǔn)相同，但是屬鑒定準(zhǔn)確率提高為8.33%和22.73%，未鑒定率降低到8.33%和15.91%，兩種方法在該水平上同樣差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖1。3種判斷水平上，兩種前處理方法準(zhǔn)確率在統(tǒng)計(jì)學(xué)無明顯差異， SepsityperTMKit鑒定的準(zhǔn)確率均略高于血清分離膠促凝管法。在Cutoff-3判斷標(biāo)準(zhǔn)下，兩種方法均有較高的準(zhǔn)確率，因此我們將Cutoff-3作為本次實(shí)驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 兩種前處理方法鑒定不同革蘭陰性菌的比較

本次收集革蘭陰性菌70株，不同細(xì)菌的鑒定結(jié)果見表1。 MALDI SepsityperTMKit 和分離膠促凝管法對血培養(yǎng)快速鑒定革蘭陰性菌準(zhǔn)確率分別為98.57%和 95.71%，前者鑒定率稍高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩種前處理方法對臨床感染常見的革蘭陰性病原菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌均有很高的鑒定準(zhǔn)確率。

2.3 兩種前處理方法鑒定不同革蘭陽性菌的比較

本次收集革蘭陽性菌57株，不同細(xì)菌鑒定結(jié)果見表2。 MALDI SepsityperTMKit 和分離膠促凝管法對血培養(yǎng)快速鑒定革蘭陽性菌準(zhǔn)確率分別為87.72%和78.59%，前者正確率稍高，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩種前處理方法鑒定臨床上常見的革蘭陽性病原菌如金黃色葡萄球菌、腸球菌屬均有較高的正確率，而對感染較為少見的棒狀桿菌屬的鑒定準(zhǔn)確率較低。

無論選擇MALDI SepsityperTMKit 或血清分離膠促凝管法進(jìn)行前處理，MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽性革蘭陰性菌的鑒定準(zhǔn)確率均高于革蘭陽性菌，分別為98.57%對87.72%， 95.71%對78.59%。

圖1 MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法對陽性血培養(yǎng)快速鑒定微生物的比較Figure 1 MALDI-TOF MS rapid identi fi cation of microorganisms in a blood culture system using two pretreatment methods（Sepsityper? kit and serum separator tube）

表1 MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法對血培養(yǎng)陽性MALDI-TOF MS鑒定革蘭陰性菌的比較Table 1 MALDI-TOF MS identi fi cation of gram-negative bacteria following pretreatment with SepsityperTMkit and serum separator tube[n（%）]

2.4 真菌和復(fù)數(shù)菌

本次研究中，只有3株真菌，MALDI SepsityperTMKit鑒定正確2株，血清分離膠促凝管法均未鑒定出。2例復(fù)數(shù)菌感染，1例為大腸埃希菌和腸球菌混合感染，兩種方法均鑒定正確，另1例為熱帶念珠菌和屎腸球菌感染，兩種方法均未鑒定出。

3 討論

血流感染是一種非常嚴(yán)重的全身感染性疾病，有研究顯示，每推遲1 h使用抗生素進(jìn)行合理治療，患者的存活率下降7.6%[9]。MALDI-TOF MS是近年來新興的細(xì)菌鑒定技術(shù)，其鑒定快速，因此有研究人員將其應(yīng)用到血培養(yǎng)陽性的鑒定中，極大地縮短了鑒定時(shí)間。血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的前處理對鑒定起到了至關(guān)重要的作用。Kok等[10]發(fā)現(xiàn)，MALDI SepsityperTMKit聯(lián)合MALDI-TOF MS，可將血培養(yǎng)陽性標(biāo)本鑒定時(shí)間縮短至1 h，而本實(shí)驗(yàn)室也在前期實(shí)驗(yàn)中探索出一種血清分離膠促凝管法的前處理方法。我們以傳統(tǒng)培養(yǎng)出純菌落再進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，以評估兩種前處理方法的效果。

表2 MALDI SepsityperTMKit 和血清分離膠促凝管法對血培養(yǎng)陽性MALDI-TOF MS鑒定革蘭陽性菌的比較Table 2 MALDI-TOF MS identi fi cation of gram-positive bacteria following pretreatment with SepsityperTMkit and serum separator tube[n（%）]

血培養(yǎng)瓶中存在紅細(xì)胞、白細(xì)胞等物質(zhì)，可能會干擾微生物的質(zhì)譜峰，因此采用質(zhì)譜儀直接鑒定血培養(yǎng)陽性的微生物需調(diào)整質(zhì)譜評分標(biāo)準(zhǔn)[11]。多宗文獻(xiàn)表明[12-14]，根據(jù)血培養(yǎng)中微生物的提取方法與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的不同，其Cutoff值可降低至1.50～1.70。因此我們采取了兩種修訂的Cutoff值。通過比較發(fā)現(xiàn)，依據(jù)Cutoff-3值標(biāo)準(zhǔn)（≥1.8鑒定到“種”水平，介于1.8～1.6鑒定到“屬”水平，如果得分≤1.6，但鑒定結(jié)果前3位均屬于同一種菌也認(rèn)為鑒定正確，否則鑒定不可靠），MALDI SepsityperTMKit和血清分離膠促凝管法均有很高的鑒定準(zhǔn)確率，因此我們選擇Cutoff-3值作為本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)譜評分標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)也有實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身特點(diǎn)制定了適合自己的實(shí)驗(yàn)室評分標(biāo)準(zhǔn)，如李媛睿等[15]將病原菌種屬質(zhì)譜評分標(biāo)準(zhǔn)定為1.50和1.45。

與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，兩種前處理方法聯(lián)合MALDI-TOF MS有共同的優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，直接提取，將鑒定結(jié)果的反饋時(shí)間縮短了至少2 d。但這兩種前處理方法又有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。國外實(shí)驗(yàn)室多采用廠商推薦的科研用Sepsityper配套試劑盒，但成本過高，處理時(shí)間平均40 min/樣本[16]； 血清分離膠促凝管法整個(gè)過程僅需約25 min/樣本的處理時(shí)間，且分離膠促凝管作為耗材在各醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用廣泛，成本低廉、實(shí)用性強(qiáng)。SepsityperTMKit鑒定的準(zhǔn)確率略高于血清分離膠促凝管法（91.67%對84.09%），但無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在真菌鑒定方面，由于本次納入菌數(shù)少，很難推斷兩種方法的準(zhǔn)確性，而且不同真菌的血流感染治療選擇的藥物不同[17]，真菌引起的血流感染更為嚴(yán)重[18-19]，如何提高M(jìn)ALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本中真菌準(zhǔn)確率，也是亟需解決的一個(gè)問題，這也為我們以后的研究提供了方向。

MALDI SepsityperTMKit和血清分離膠促凝管法兩種前處理方法均可以用于MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本，與前者相比，后者是一種快速、易獲得、低廉的MALDI-TOF MS直接鑒定血培養(yǎng)病原菌的前處理方法。實(shí)驗(yàn)室也可以依據(jù)自身特點(diǎn)和數(shù)據(jù)建立自己的質(zhì)譜評分標(biāo)準(zhǔn)，選擇合適的前處理方法，從而快速準(zhǔn)確地將結(jié)果反饋臨床，指導(dǎo)臨床抗生素的合理使用。

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Performance assessment of MALDI Sepsityper? kit and serum separator tube as pretreatment methods for direct identi fication of microorganisms from blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry

QIN Juanxiu, HUANG Qian, GAO Qianqian, XIE Yihui, LI Min, ZHANG Haomin. （Department of Laboratory Medicine, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China）

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0546-06

10.16718/j.1009-7708.2017.05.012

2017-01-17

2017-04-17

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200127。

秦娟秀（1989—）﹐女﹐碩士研究生﹐初級檢驗(yàn)師﹐主要從事病原微生物的致病機(jī)制研究。

張灝旻﹐E-mail：zhanghaomin1976@163.com。