樺褐孔菌菌株的分離鑒定及液體優(yōu)化培養(yǎng)

郭素萍，趙金芬，董彩虹

1.山西康欣藥業(yè)有限公司，山西呂梁 030006；2.中科院微生物研究所，北京 100101

樺褐孔菌菌株的分離鑒定及液體優(yōu)化培養(yǎng)

郭素萍1，趙金芬1，董彩虹2

1.山西康欣藥業(yè)有限公司，山西呂梁 030006；2.中科院微生物研究所，北京 100101

樺褐孔菌（Inonotusobliquus）是一種十分珍稀而名貴的藥用真菌，主要分布在俄羅斯、吉林、黑龍江一帶。 樺褐孔菌中的多糖有明顯的降血糖作用；樺褐孔菌，又稱血液血管的清潔劑，對(duì)高血壓的防治效果顯著。 樺褐孔菌化學(xué)成分有多糖、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、多種氧化三萜類化合物、栓菌酸、多種羊毛甾醇型三萜類化合物、葉酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羥基苯甲酸,還有報(bào)道稱已分離出單寧化合物、類固醇、生物堿類化合物、黑色素類、低分子多酚類及木質(zhì)素類化合物。該文通過樺褐孔菌的野外采集、收集，分離純化得到一株樺褐孔菌菌株，經(jīng)鑒定為樺褐孔菌，代號(hào)：F83280（2014）；通過對(duì)該菌株的液體發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)，得到該菌株F83280（2014）液體培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)工藝條件，為今后開展藥效學(xué)研究提供了樣品及可靠數(shù)據(jù)。

樺褐孔菌；新菌株；分離鑒定；液體培養(yǎng)

樺褐孔菌屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬。是一種生于樺樹上的藥用真菌，其子實(shí)體呈現(xiàn)類似于碳的黑色塊狀形態(tài)。外表黑灰，有不規(guī)則溝痕，內(nèi)部黃色，無柄，直徑25～40 cm，深色，表面深裂，很硬。菌肉木柱質(zhì)，有輕微的、模糊不清的環(huán)紋，鮮（明亮）淡黃褐色。樺褐孔菌是前蘇聯(lián)各共和國(guó)、波蘭、日本等國(guó)的民間常用藥物，人們已從菌核和菌絲中提取到一種糖蛋白（FIS-1）和一種水溶性多糖（F1），發(fā)現(xiàn)均有明顯的降血糖作用。尤其是水溶性多糖 （F1），一次性給藥50 mg/kg體重，3 h后，高血糖鼠的血糖含量下降近一半，且可維持48 h之久；樺褐孔菌，又稱血液血管的清潔劑，對(duì)高血壓的防治效果顯著。相關(guān)文獻(xiàn)載：俄羅斯堪索莫樂斯基制藥公司生產(chǎn)的樺褐孔菌精粉對(duì)高血壓的有效率達(dá)93%，樺褐芝被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的科研和臨床。當(dāng)樺褐孔菌10～15年后起藥效時(shí)，它能吸干樺木的精髓，使樹木枯死。樺褐孔菌主要分布于俄羅斯北部、北歐、中國(guó)黑龍江、中國(guó)海南、日本（北海道），滋生在北半球北緯40～50°的地區(qū)。

1 菌種的分離鑒定

培養(yǎng)特征：28℃恒溫培養(yǎng)10 d，肉眼逐日觀察菌絲形態(tài)變化，培養(yǎng)3 d后平皿中央菌快周圍有白色絨狀菌絲出現(xiàn)；培養(yǎng)5 d后，菌落不斷擴(kuò)展，菌絲白色逐漸加粗；培養(yǎng)8 d后，菌落擴(kuò)展到平皿1/2，菌絲體逐漸匍匐于培養(yǎng)基上，由白色逐漸變黃；培養(yǎng)10 d后，菌落繼續(xù)擴(kuò)展，菌絲體由黃色向棕色轉(zhuǎn)變，并有模糊的環(huán)紋出現(xiàn)，菌落表面有菌孔，并出現(xiàn)黃褐色液珠，鏡檢無孢子產(chǎn)生。如圖1、圖 2。

圖1 F83280（2014）菌株斜面培養(yǎng)

圖2 F83280（2014）菌株培養(yǎng)皿培養(yǎng)10 d后的情況

2 樺褐孔菌F83280（2014）液體培養(yǎng)基優(yōu)化篩選

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇

搖床培養(yǎng)條件：28℃150 rpm/min，根據(jù)文獻(xiàn)選擇了如下3種培養(yǎng)基進(jìn)行了初步試驗(yàn)。鑒定結(jié)果為：樺褐孔菌 Inonotus obliquus(Ach.ex Pers.)Pilát 1942。分類地位：Hymenochaetaceae,Hymenochaetales,Incertae sedis,Agaricomycetes,Agaricomycotina,Basidiomycota,Fungi。

圖3 F83280（2014）337顯微形態(tài)觀察情況

2.1.1 PDB培養(yǎng)基 觀察搖床培養(yǎng)的菌種F83280（2014）PDB液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況，4 d生長(zhǎng)緩慢，不適合PDB液體培養(yǎng)基，需要重新配置新的液體培養(yǎng)基。

2.1.2 黃豆粉培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L，黃豆粉30 g/L，KH2PO4，3 g/L，MgSO41.5 g/L VB10.1 g/L，pH6 左右。

2.1.3 葡萄糖蛋白胨酵母提取物培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L，大豆蛋白胨 3 g/L，酵母提取物，2 g/L KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，VB10.1 g/L，pH6左右。3種培養(yǎng)基中均長(zhǎng)勢(shì)較差。

2.2 接種方式的選擇

考慮到PDB培養(yǎng)基和黃豆粉培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)均較差，所以摸索了接種方法。

①整個(gè)平板337A加40 mL水碾碎，取5 mL接種。見圖4。

按照此方法接種，菌種生長(zhǎng)速率明顯提高，只是方法比較麻煩，接種量不能很好控制。

②采用攪拌機(jī)，將平板菌種打碎后接種，效果明顯。因此后面均采用該方法。

2.3 碳源試驗(yàn)

選用黃豆粉培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，黃豆粉 30 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4，1.5 g/L，VB1 0.1 g/L，pH6左右。用可溶性淀粉，糊精，蔗糖，乳糖，麥芽糖，白砂糖，山梨醇，甘露醇，結(jié)晶纖維素等替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，每個(gè)處理重復(fù)3次，一組對(duì)照試驗(yàn)，不添加任何碳源，其他與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。其離心烘干，測(cè)其干重，SPASS結(jié)果分析如下。

圖4 F83280（2014）337A平板培養(yǎng)好后，加40 mL水碾碎，取5 mL接種

從表1中碳源、氮源的比較試驗(yàn)中可以看出，以葡萄糖作為碳源效果最好，其次是糊精、蔗糖。

2.4 氮源試驗(yàn)

用(NH4)2SO4，NaNO3，KNO3等替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的黃豆粉，結(jié)果見表1。從表1中碳源、氮源的比較試驗(yàn)中可以看出，以蛋白胨為氮源最好，其次是牛肉膏、酵母提取物。

表1 碳源、氮源的比較試驗(yàn)[（±s），g/L]

表1 碳源、氮源的比較試驗(yàn)[（±s），g/L]

碳源 菌絲干重 氮源 菌絲干重單糖類D-(-)-阿拉伯糖D-(+)-木糖D-(-)-果糖D-(+)-半乳糖D-(+)-葡萄糖雙糖類D-(+)-纖維二糖乳糖麥芽糖蔗糖多糖類纖維素糊精麥芽提取物果膠可溶性淀粉糖醇類D-甘露醇D-山梨醇有機(jī)酸檸檬酸對(duì)照（沒有碳源）1.96±0.18 2.05±0.03 3.12±0.34 3.25±0.53 6.69±0.40 4.73±0.24 3.51±0.20 5.33±0.25 6.26±0.25 ND2 5.08±0.48 4.00±0.07 2.69±0.32 4.80±0.09 4.45±0.05 4.05±0.66 2.51±0.82 2.72±0.11無機(jī)氮硝酸銨硫酸銨氯化銨硝酸鉀硝酸鈉尿素氨基酸甘氨酸L-天冬氨酸L-谷氨酸L-敕氨酸L-甲硫氨酸e L-色氨酸復(fù)合氮源牛肉膏干酪素蛋白胨酵母提取物對(duì)照(沒有氮源)2.67±0.28 2.18±0.24 2.22±0.12 3.62±0.25 2.85±0.16 2.03±0.23 1.72±0.11 3.12±0.26 2.97±0.11 1.99±0.19 2.05±0.04 2.04±0.19 5.84±0.52 ND 6.58±1.32 3.97±0.43 2.74±0.18

2.5 碳氮比值

根據(jù)碳氮源試驗(yàn)的結(jié)果，在下述營(yíng)養(yǎng)需求的試驗(yàn)中蔗糖和蛋白胨分別用作碳氮源。

如表2所示配制8種不同的碳氮比值但是有相同的總有機(jī)物質(zhì)含量的培養(yǎng)基。

表3中可以得出，菌絲生長(zhǎng)的最適C/N為12：1，高或低于12：1時(shí)菌絲生物量都會(huì)下降，但是C/N為12：1時(shí)的生物量和 C/N 為 6：1，18：1，24：1，36：1 和 48：1 時(shí)的生物量沒有顯著性差別。

表2 不同碳氮比值的液體培養(yǎng)基組成

表3 碳氮比值對(duì)冬蟲夏草菌菌絲生長(zhǎng)的影響[（±s），g/L]

表3 碳氮比值對(duì)冬蟲夏草菌菌絲生長(zhǎng)的影響[（±s），g/L]

碳氮比值 菌絲干重1:1 6:1 12:1 18:1 24:1 36:1 48:1 96:1 1.10±0.44 6.02±1.09 7.10±0.29 6.48±0.68 5.85±0.53 5.86±0.40 5.87±0.82 5.03±0.21

表4 正交試驗(yàn)L8（27）優(yōu)化菌絲生長(zhǎng)的半合成培養(yǎng)基

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L8(27)的方差分析

2.6 碳氮源濃度優(yōu)化

從表4和表5中可以看出：通過應(yīng)用上述優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基驗(yàn)證試驗(yàn)，得到平均生物量為22.15 g/L，與正交試驗(yàn)中相同濃度組合的培養(yǎng)基生物量23.69 g/L相近，表明優(yōu)化得到的培養(yǎng)基實(shí)踐中是可靠的。

3 結(jié)論

適合樺褐孔菌菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖30 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 0.5%，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，VB10.1 g/L，pH6，溫度 28～30°C。其關(guān)鍵為接種方式，最好采用攪拌機(jī)將種子打碎接種。

[1]孫海峰,孫慧峰,郭冷秋,等.均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝的研究[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2011，13（1）：124-128.

[2]何堅(jiān),馮孝章.樺褐孔菌化學(xué)成分的研究[J].中草藥,2001,32（1）：4-6.

[3]黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌—樺褐孔菌[J].中國(guó)食用菌，2002，21（4）：7-8.

[4]陳艷秋.樺褐孔菌菌株遺傳多樣性及人工培養(yǎng)條件優(yōu)化模式研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

R931.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1672-5654（2017）08（c）-0052-04

2017-05-19）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.24.052

國(guó)家科技部國(guó)際科技合作項(xiàng)目：特殊蕈菌資源挖掘及評(píng)價(jià)利用的聯(lián)合研發(fā)（2014DFR31050）。

郭素萍（1960-），女，山西五臺(tái)人，本科，教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事微生物菌種選育、分離、培養(yǎng)及藥用真菌研究工作。