四種氨基酸神經遞質對斑馬魚胚胎發育和成體組織再生的雙重影響

李心雨，劉亞平，杜新路，嚴繼舟

(上海海洋大學水產與生命學院生物系，上海 201306)

四種氨基酸神經遞質對斑馬魚胚胎發育和成體組織再生的雙重影響

李心雨，劉亞平，杜新路，嚴繼舟

(上海海洋大學水產與生命學院生物系，上海 201306)

篩選小分子化合物促進組織再生仍然是再生醫學的一個巨大挑戰。前期研究提示神經遞質在斑馬魚(Daniorerio)下頜再生過程中發揮著重要作用。本實驗分別剪切Flk-GFP轉基因斑馬魚成體下頜組織和1月齡幼魚尾鰭，然后將其置入四種神經遞質(牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸以及γ-氨基丁酸)的濃度梯度環境中，培養5 d后取成魚下頜制作冰凍切片進行觀察檢測新生血管熒光量，對幼魚尾鰭再生進行長度測量。結果顯示甘氨酸和γ-氨基丁酸對損傷組織的再生表現出促進作用，而牛磺酸和谷氨酸表現出在低濃度時促進與高濃度的抑制作用。胚胎培養和早期胚胎細胞增生的MTT試驗進一步驗證了氨基酸神經遞質在不同濃度所表現出的細胞營養和毒性作用。結果提示有必要建立一個多層面包括從細胞-胚胎-幼魚和成魚的斑馬魚檢測系統,能有效篩選再生相關小分子化合物及其合適濃度。

神經遞質；牛磺酸；谷氨酸；甘氨酸；γ-氨基丁酸；斑馬魚(Daniorerio)；組織再生

Abstract：Screening small molecules targeting tissue regeneration remains challenge in regenerative medicine.The previous investigations have indicated that neurotransmitters play important roles in the process of regeneration inDanioreriojaw.Flk-GFP transgenicD.rerioadult jaw and 1-month-old caudal fins were separately cut in this study,and then rear the damaged fishes for 5 days in the presence of four amino acid neurotransmitters (taurine,glutamate,glycine,and γ- aminobutyric acid (GABA)) at gradient concentrations.Their effects on tissue regeneration were compared by measuring GFP intensity of cryosections,or by measuring the caudal fin regeneration length.The results showed that glycine and GABA promote damaged tissue regeneration,while taurine and glutamate exhibit promotion at low concentrations and inhibition at high concentrations.D.rerioembryo culture and MTT assays on embryonic cell proliferation further demonstrate the dosage dependent- cell nutrition and cytotoxicity of the four amino acid neurotransmitters.This experiment suggests that it is necessary to set up a multifacetedD.reriosystem covering cell,embryo,larvae and adult，which can effectively screen the regeneration-related small molecule compounds and their suitable concentrations.

Keywords：neurotransmitter；taurine；glutamate；glycine；GABA；Daniorerio；tissue regeneration

組織再生一直是許多生物研究者所研究的重要課題。再生能力在不同物種間差異很大,與人及高等脊椎動物相比,低等脊椎動物(如斑馬魚)有著較強的再生能力[1]。低等生物的組織和器官部分或全部損傷后可以完全再生，弄清它們再生的過程與調控機制，是現代再生醫學所關注的重要內容之一，將為哺乳類和人類的組織再生提供理論依據。斑馬魚(Daniorerio)作為一種極好的模式生物，具有和人類87%的同源基因，它的鰭、視神經、脊髓、心臟等都具有很強的再生能力[2],是很好的脊椎動物組織再生的初步模型系統[3]。

小分子神經遞質不僅能夠作為突觸間的信息連接，也參與到發育和組織再生的調控中。快速篩選具有促進組織再生的小分子化合物對于再生醫學具有重大研究意義。神經遞質多巴胺(dopamine,DA)和γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)在下頜再生和視網膜再生的斑馬魚的腦部和再生局部器官都出現動態變化[4]。目前尚未有系統比較牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸以及γ-氨基丁酸在胚胎發育和成體組織再生方面的報道。本實驗的目的是研究牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸以及γ-氨基丁酸這四種神經遞質在斑馬魚下頜以及尾鰭組織再生中的作用，以期構建一個活體斑馬魚系統模型，用于快速篩選組織再生相關的小分子物質。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實驗用魚

實驗用魚為本實驗室繁殖傳代的AB野生型和Flk1-GFP轉基因斑馬魚，作為血管再生的標志[5]。

1.1.2 實驗試劑

牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、多聚甲醛、MTT試劑盒(以上試劑均購自上海生工生物有限公司)、DAPI封片劑(Sigma)

1.2 實驗方法：

1.2.1 組織取材

為了比較氨基酸神經遞質對組織再生的影響，實驗選取斑馬魚成魚為研究對象，每組3～5尾，分缸培養。實驗前用0.05%的MS-222對斑馬魚進行短暫麻醉處理，再用手術剪刀剪除下頜前端約1/3部分，剪切后將魚分別置于牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸的濃度梯度環境中，于5 d后再次剪切，制作冰凍切片。

為了說明高濃度氨基酸神經遞質對組織再生有抑制作用，我們比較高濃度氨基酸(1 mmol/L和4 mmol/L)對尾鰭再生的效果。實驗選取約1月齡斑馬魚為研究對象，每組3～5尾，分缸培養。實驗前用0.05%的MS-222對斑馬魚進行短暫麻醉處理，再用手術剪刀從其尾鰭開叉處剪切，剪切后將魚置于牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸的濃度環境中，分別于第2天和第5天在體視熒光顯微鏡 (Zeiss Stereo Disccovery v12)下觀察拍照。

1.2.2 冰凍切片的制備

方法詳見參考文獻[6]

1.2.3 細胞增殖及細胞活力測定

根據濃度梯度預實驗結果，將剛孵出的胚胎置于四種氨基酸的三種濃度環境(0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，1 mmol/L)中，設置空白對照，在恒溫箱中靜置4 h。手工去膜后，再置于MTT試劑中培養4 h，使用酶標儀(microplate reader)在570 nm下測定吸光度值(OD value)。

1.2.4 數據分析和處理

1.2.4.1 圖像數字化處理

借助Adobe Photoshop CC (64 Bit) 測定四種藥物各濃度梯度影響后第5天下頜相同大小區域Flk1-GFP熒光相對強度平均值和標準差，然后根據熒光強度平均值(M)和差異系數(CV)計算再生相對強度(RI)。RI=M/CV。這里M表示血管再生強度，CV表示再生分布的差異。另外也測量尾鰭再生的長度，即新生組織距分叉處最大值。圖像數字化后，借助Graphpad Prism 6進行數據分析，做出統計圖。

1.2.4.2 OD值的統計學分析

各組測得的實驗組吸光度值與空白對照組比較,所得差值表示活細胞數量的增減。利用SPSS Statistics 19 win32統計軟件，通過單因素方差分析進行差異的顯著性檢驗；運用Duncan多重比較檢驗差異，取P<0.05為差異顯著。比較方法常用標字母法，凡有相同字母的平均數即表示差異不顯著，凡無相同字母的平均數即表示差異顯著。

2 結果

2.1 四種氨基酸神經遞質對成魚下頜組織再生的影響

根據GFP綠色熒光相對強度和相對再生強度的測定結果(圖1)，與未剪切組相比，牛磺酸(Taurine)只在0.1 mmol/L濃度時有著較好的促進效果，血管增生相對增多。而在0.05 mmol/L及1 mmol/L濃度時，血管熒光信號強弱不等，分布不均勻，離散程度大。

圖1 牛磺酸對血管再生的影響及其相對再生強度分析Fig.1 The effect of taurine on blood vessel regeneration and analysis of dosage-dependent relative regenerative intensity.(A)未剪切下頜(CK)；(B)-(D)剪切1/3的下頜分別置于牛磺酸濃度為0.05、0.1和1 mmol/L。

由圖2可見，谷氨酸在0.05 mmol/L濃度時表現出明顯促進再生作用，在0.1 mmol/L以及1 mmol/L濃度時則表現出抑制的作用，整體趨勢為低濃度促進，高濃度抑制。與未剪切組相比，在高濃度(1 mmol/L)時熒光分布更不均勻，離散程度大。

圖2 谷氨酸對血管再生的影響及其相對再生強度分析Fig.2 The effect of Glu on blood vessel regeneration and analysis of dosage-dependent relative regenerative intensity.(A)未剪切下頜(CK)；(B)-(D)剪切1/3的下頜分別置于谷氨酸(Glu)濃度為0.05、0.1和1 mmol/L

甘氨酸表現出對血管再生有一定的促進作用，特別是0.05 mmol/L時，熒光信號強，且分布密集。但在1 mmol/L時能抑制血管的增生(圖3)。與未剪切組相比，三種不同甘氨酸濃度下都呈現熒光均勻分布狀態。

γ-氨基丁酸對于下頜再生與谷氨酸表現出相似的作用，即在0.05 mmol/L和0.1 mmol/L濃度下表現出較好的促進作用，而在1 mmol/L時呈現抑制增生的結果(圖4)。同時，與未剪切組相比，在1 mmol/L時熒光分布更不均勻，離散程度大。

總之，四種氨基酸神經遞質都具有促進組織再生的功能，但促進組織再生的合適濃度不盡相同。牛磺酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸濃度分別為0.1，0.05,0.05和0.1 mmol/L。當氨基酸濃度增加到1 mmol/L濃度時，四種氨基酸都表現為抑制作用。

圖3 甘氨酸對血管再生的影響及其相對再生強度分析Fig.3 The effect of Gly on blood vessel regeneration and analysis of dosage-dependent relative regenerative intensity.(A)未剪切下頜(CK)；(B)-(D)剪切1/3的下頜分別置于甘氨酸(Gly)濃度為0.05、0.1和1 mmol/L

圖4 γ-氨基丁酸對血管再生的影響及其相對再生強度分析Fig.4 The effect of GABA on blood vessel regeneration and analysis of dosage-dependent relative regenerative intensity.(A)未剪切下頜(CK)；(B)-(D)剪切1/3的下頜分別置于γ-氨基丁酸(GABA)濃度為0.05、0.1和1 mmol/L。

2.2 四種氨基酸神經遞質對幼魚尾鰭組織再生的影響

與剪切不加氨基酸對照組相比，四種神經遞質在4 mmol/L濃度時，均表現出對尾鰭再生有不同程度的抑制作用，從強到弱依次為谷氨酸、γ-氨基丁酸、牛磺酸和甘氨酸。只有甘氨酸在2 dpa時表現出促進再生作用。圖5為4 mmol/L氨基酸處理各組尾鰭剪切2 d(2 dpa)和5 d(5 dpa)后再生長度的測量結果。與未剪切組相比，可以看到剪切的尾鰭組織在5 d時已長出原有尾鰭的一半以上，其中，牛磺酸和甘氨酸具有較好的再生效率，恢復率分別為60%～70%。

2.3 四種氨基酸神經遞質對胚胎發育的影響

結果顯示4 mmol/L的四種氨基酸神經遞質對胚胎存活均有不同影響。添加氨基酸20 h后，各試驗組胚胎存活率均逐漸下降；48 h后牛磺酸組和GABA組胚胎全部死亡，60 h谷氨酸組胚胎死亡，只有甘氨酸組還有存活的胚胎 (圖6)。

MTT實驗結果顯示0.05 mmol/L下，牛磺酸組細胞存活明顯高于谷氨酸和甘氨酸組，但其他氨基酸組之間無顯著差異；0.1 mmol/L下，牛磺酸組明顯低于其它組，谷氨酸組明顯高于甘氨酸組。在1 mmol/L下，除甘氨酸與GABA之間無顯著差異外，牛磺酸明顯低于谷氨酸，后者又明顯低于甘氨酸和GABA(圖7)。實驗表明：不同藥物不同濃度，對細胞增殖狀況有不同影響。其中，細胞對牛磺酸濃度增加最敏感，而對GABA濃度變化不敏感，與體內試驗結果相符。

圖5 四種氨基酸神經遞質對幼魚尾鰭再生的影響.Fig.5 Effects of four amino acid neurotransmitters on the regeneration of larval cadual fins(注：Taurine：牛磺酸；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；GABA：γ-氨基丁酸)

圖6 四種氨基酸對胚胎發育的影響Fig.6 Effects of four amino acids on the embryonic development

圖7 早期胚胎分別置于四種小分子不同濃度的相對吸光度Fig.7 The OD value of early embryos relative to control凡有相同字母的即為差異不顯著，凡無相同字母的即為差異顯著

3 討論

機體損傷后不僅激發局部組織器官修復，而且激發全身資源的重新分配，其中神經組織通過神經遞質發揮重要調節作用[4]。神經遞質不僅介導神經元之間和神經元與效應器之間的信息傳遞，而且作為細胞外環境中的一員也參與了神經干細胞(NSC)的增殖和分化。但目前神經遞質受體在NSC增殖和分化中的表型變化尚不完全清楚，神經遞質以及神經遞質受體在NSC增殖和分化中信號轉導的研究也不多見。谷氨酸作為一種興奮性神經遞質，可以作為神經營養劑或者神經毒性劑[7]。一些資料表明，在腦的發育過程中有高含量的谷氨酸表達。谷氨酸對神經細胞分化也有作用，它可促進神經元生長和分化，NMDAR(谷氨酸離子型受體)激活可促進小腦顆粒神經元神經突起的過度生長以及海馬細胞的分芽[8]，并可促進神經突觸的形成。在斑馬魚下頜修復過程中，下頜、腦部和肝臟部位從修復 2 h開始谷氨酸和甘氨酸含量便呈現上升的趨勢，到2 d時達到高峰，隨后便緩慢下降[9]。對產后大鼠施加代謝型谷氨酸受體激動劑，會產生視神經萎縮，并引發視網膜毒性[10]。此外，谷氨酸大劑量時會導致大鼠海馬細胞死亡[11,12]，小鼠腦皮層細胞死亡[13]，以及大鼠視網膜神經節細胞死亡[14]。本實驗證實谷氨酸在低濃度時表現出促進再生，在高濃度時則抑制再生和胚胎發育，甚至導致胚胎細胞死亡。

甘氨酸在中樞神經系統，尤其是在脊椎、腦干和一些腦區，甘氨酸受體(GlyR)通過增加突觸后細胞膜Cl-通透性而起突觸后抑制作用，是一個抑制性神經遞質。但在本實驗中，甘氨酸表現出促進再生效果。另一個抑制性神經遞質GABA，也對組織再生表現出促進作用。已有研究表明[15],GABA可促進胚胎大鼠脊髓和皮質神經細胞的遷移，并可部分促進大鼠海馬錐體神經元、小鼠顆粒神經元和胚胎雞頂蓋神經元神經突起的生長。本實驗中，甘氨酸與GABA的最適濃度不一樣，分別在0.05 mmol/L和0.1 mmol/L具有較突出的組織再生促進作用。另外，胚胎細胞對二者濃度變化有較好的耐受性，特別是GABA。

牛磺酸是中樞神經系統最豐富的游離氨基酸之一，其各種生物學功能可以作為調制生物體的激動劑[16]。眾多研究表明，牛磺酸可使受損的神經，如大鼠海馬齒狀回區神經元再生、視網膜光化學損傷以及其它組織的修復、再生，以及在生長發育中都有著重要的作用。牛磺酸可以提高金魚視網膜外植體突起的長度和密度[17]，這個過程是通過增加鈣通量的營養作用來進行的[18]。與先前的研究不同，本實驗發現牛磺酸有嚴格的濃度限制。只是在0.1 mmol/L濃度時表現出最佳的促進下頜組織的再生作用，濃度增高相反會表現出細胞毒性。

本實驗結果充分體現了不同濃度的氨基酸神經遞質在組織再生的促進和抑制雙重作用。第一，興奮性神經遞質和抑制性神經遞質在組織再生過程中都是必要的，扮演精細調節角色。在斑馬魚下頜修復早期，興奮性遞質如 多巴胺 和谷氨酸含量增加的速度明顯高于抑制性遞質 GABA 和 甘氨酸，即興奮性遞質的釋放很可能是在傳遞著下頜細胞增殖和組織修復的信號[9]。顯然興奮性氨基酸過度刺激會損害組織的再生。第二，這些神經遞質不僅以遞質的形式存在，同時還是物質和能量代謝的重要成份，參與細胞新陳代謝，表現出營養和毒性。在低濃度時較多體現在物質代謝中的作用，在高濃度時作為神經遞質的調節作用得到凸顯。相比之下，GABA在三種濃度下均具有促進增殖作用，而高濃度(1 mmol/L)谷氨酸具有明顯毒性效應。這一點在組織再生和胚胎發育的作用是一樣的。實時檢測氨基酸神經遞質的含量和平衡能動態，有助了解再生組織細胞間的神經調節和再生細胞的新陳代謝狀況。組織再生依賴再生細胞彼此之間的協作，其代謝系統整體之間的氨基酸水平的精細調節十分重要。

總之，本實驗從斑馬魚胚胎、幼魚尾鰭和成體器官以及胚胎細胞水平揭示了氨基酸神經遞質在胚胎發育、成體組織再生和胚胎細胞增生具有不相一致的調節作用，比如，0.1 mmol/L牛磺酸最適合下頜組織再生；而在細胞水平，0.05 mmol/L牛磺酸最利于胚胎細胞增生。同樣，0.05 mmol/L谷氨酸最適于下頜組織再生；而0.1 mmol/L濃度胚胎細胞生長最好。如果選用氨基酸神經遞質混合物，最佳合適濃度將定為0.05 ～0.1 mmol/L濃度。因此利用一個完整檢測系統，可有效篩選發育和組織再生相關的小分子藥物及其濃度。

致謝：上海海洋大學海洋生物系和神經科學研究所老師和同學對本課題研究給予了許多幫助，在此表示感謝。

[1]嚴麗鋒,顧愛華.斑馬魚在再生醫學研究中的應用及進展[J].遺傳,2013,35(7):856-866.

[2]Shin J T,Fishman M C.From zebrafish to human:modular medical models[J]. Annu Rev Genomics Hum Genet,2002,3:311-340.

[3]Gemberling M,Bailey T J,Hyde D R,et al.The zebrafish as a model for complex tissue regeneration [J]. Trends Genet,2013,29(11):611-620.

[4]楊 欽,王箕雨,吳 昊,等.多巴胺和γ-氨基丁酸在斑馬魚損傷性組織再生的表達特征分析[J].基因組學與應用生物學,2017,36(1):1-9.

[5]曹靜暉,魏雅嵐,嚴繼舟.在斑馬魚仔魚腦部異體移植胚胎細胞的嘗試[J].淡水漁業,2016,46(4):3-8.

[6]Zhang H,Wen W,Yan J.Application of immunohistochemistry technique in hudrobiological studies [J],Aquacult Fish,2017,(2):140-144.

[7]Lipton S A,Kater S B.Neurotransmitter regulation of neuronal outgrowth plasticity and survival [J]. Trends Neurosci,1989,12(7):265-270.

[8]Wilson M T,Kisaalita W S,Keith C H.Glutamate-induced changes in the pattern of hippocampal dendrite outgrowth:a role for calcium-dependent pathways and the microtubule cytoskeleton [J]. J Neurobiol,2000,43(2):159-172.

[9]吳 昊,李 利,李先瑞,等.斑馬魚下頜損傷后的再生組織的超微結構觀察及神經遞質分析[J].農業科學,2014,(4):73-80.

[10] Fix A S,Horn J W,Hall R L,et al.Progressive retinal toxicity in neonatal rats treated with D,L-2,amino-3-phosphonopropionate (D,L-AP3) [J]. Vet Pathol,1995,32(5):521-531.

[11]Mattson M P,Dou P,Kater S B.Outgrowth-regulating actions of glutamate in isolated hippocampal pyramidal neurons [J]. J Neurosci,1988,(8):2087-2100.

[12]Rothman S M,Thurston J H,Hauhart R E.Delayed neurotoxicity of excitatory amino acids in vitro [J]. Neurosci,1987,22(2):471-480.

[13]Choi D W,Maulucci-Gedde M A,Kriegstein A R,Ionic dependence of Glutamate neurotoxicity [J]. J Neurosci,1987,7(2):369-379.

[14]Hahn J S,Aizenman E,Lipton S A.Central mammalian neurons normally resistant to glutamate toxicity are made sensitive by elevate extracellular Ca2+:Toxicity is blocked by the N-methyl-D-aspartate antagonist MK-801 [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1988,85(17):6556-6560.

[15]Behar T N,Schaffner A E,Scott C A,et al.GABA receptor antagonists modulate postmitotic cell mgiation in slice cultures of embryonic rat cortex [J]. Cerebral Cortex,2000,10(9):899-909.

[16]Caletti G,Olguins D B,Pedrollo E F,et al.Antidepressant effect of taurine indiabetic rats [J]. Amino Acids,2012,43(4):1525-1533.

[17]Lima L,Matus P,Drujan B,et al.Taurine effect on neuritic growth from goldfish retinal explants [J]. Int J Dev Neurosci,1988,6(5):417-424.

[18]Lima L,Matus P,Drujan B.Taurine-induced regeneration of goldfish retina in culture may involve a calcium-mediated mechanism [J]. J Neurochem,1993,60(6):2153-2158.

DualeffectsoffouraminoacidneurotransmittersonDaniorerioembryonicdevelopmentandadulttissueregeneration

LI Xin-yu,LIU Ya-ping,DU Xin-lu,YAN Ji-zhou

(DepartmentofBiology,CollegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

2017-03-12；

2017-07-12

上海市教委大學生科研創新項目(B-5106-13-0001)；上海市教委水產高峰學科項目(A1-2035-17-0001B3-12)

李心雨(1997- )，專業方向為水生生物學。E-mail:975683903@qq.com

嚴繼舟。Email:jyan2@shou.edu.cn

S942.1

A

1000-6907-(2017)05-0058-06