基于碳點標記的（1-3）-β-D葡聚糖的熒光檢測方法

葛宇新，張洋，田振華，于源華，郭瑞，張昊

（1.長春理工大學 校醫院，長春 130022；2.長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

基于碳點標記的（1-3）-β-D葡聚糖的熒光檢測方法

葛宇新1，張洋2，田振華2，于源華2，郭瑞2，張昊2

（1.長春理工大學 校醫院，長春 130022；2.長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

血清中（1，3）-β-D葡聚糖（βG）的含量已經成為臨床上檢測侵襲性真菌感染的指標，利用原核表達并純化獲得能夠與βG特異性結合的美洲鱟屬G因子α亞基片段a（Gαa）蛋白，將Gαa蛋白與碳點偶聯獲得生物熒光傳感器“碳點/Gαa蛋白”，建立基于碳點標記的βG熒光檢測方法。經測定該傳感器的最佳的激發波長為360nm，其發射波長為470nm，且熒光強度與βG濃度呈正線性相關，該檢測方法線性范圍是9.375～150pg/mL，最低檢測限為9.375pg/mL，批間、批內精密度均不小于5%，準確度（回收率）在97%～102%之間，該方法靈敏、快速、成本低，具有廣闊的應用前景。

（1，3）-β-D葡聚糖；美洲鱟屬G因子α亞基片段a特異性蛋白；碳量子點；真菌感染

近三十年來，隨著器官移植、腫瘤化療、免疫抑制劑使用、創傷性醫療操作等的不斷增多，侵襲性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）的發病率和病死率顯著上升。美國非艾滋病患者中致死性真菌感染的發病率逐年上升［1］。

真菌的細胞壁主要成分為（1，3）-β-D葡聚糖（βG）。當真菌進入人體血液或深部組織后，經吞噬細胞的吞噬、消化等處理，βG從胞壁中釋放出來，使血液及其它體液中βG含量增高。在臨床上，正常人體血液中的（1，3）-β-D葡聚糖含量應小于10pg/mL，若含量大于20pg/mL，可診斷此病人患有侵襲性真菌感染，當含量在10pg/mL與20pg/mL之間，表明該檢驗品有（1，3）-β-D葡聚糖存在，此人存在被侵襲性真菌感染的危險［2，3］。生物標志物（G和GM試驗）分別被列入真菌診斷和治療的指南，歐洲癌癥治療研究組織和美國國家過敏癥與傳染病研究所霉菌病研究組批準用于真菌診斷［4］。因此對βG進行測定，實現真菌感染的早期診斷并對檢測結果為陽性的患者及時進行治療，是提高患者生存質量的關鍵［5-6］。

國內外關于檢測真菌（1，3）-β-D葡聚糖的方法主要為鱟試劑法：鱟試劑（鱟的血細胞提取物）在1983年首先收載于美國藥典。Fungitec-G glucan試劑主要成分是東方鱟的細胞裂解產物，其判斷標準為 20ng/L［7］；而 Glcatell試劑則使用美洲鱟的細胞裂解產物作為主要原料，使用的判斷標準為60ng/L［8-9］。這種檢測方法靈敏度很高，但是鱟血屬于天然材料，易出現資源的枯竭，目前在某些地區鱟已經被列為二級保護動物。由于鱟試劑的成本比較高，且需對樣品進行前處理，測定時間長［10-11］。因此建立靈敏、簡便、低成本檢測（1，3）-β-D葡聚糖的測定方法，對真菌感染早期診斷、治療效果和康復判斷具有重大意義。

近年來，熒光碳點（CDs）以高穩定性、低毒性、低成本的優勢，在各種生物檢測領域里起到很大的作用，熒光碳點具有獨特的性質，碳點在特定的激發波長下會產生熒光，這種熒光在碳點與其他物質結合后會隨著所加的物質濃度的上升而出現熒光峰值的上升或是下降，或者熒光峰值會出現藍移或紅移［12-14］。研究這種現象的規律與檢測所加物質濃度呈一定的關系，從而通過此規律達到對待檢測物未知濃度的檢測。

碳量子點因其粒徑小（1-10nm），從而具有獨特優越的光學、電子和表面可修飾性等性質，已成為納米生物光子學領域的新貴，被廣泛應用在生物標記領域。高質量的碳量子點溶液具備以下特點：廣泛的尺寸范圍、較窄的尺寸分布、良好的穩定性以及高熒光性。

通過鱟試劑可以檢測真菌感染，表示鱟血中存在某種特異性蛋白可以與真菌細胞壁的βG結合，因此在基因組文庫中篩選出能夠與βG特異性結合的蛋白質基因序列，利用基因重組技術，克隆該段基因，通過原核大量表達Gαa蛋白，過親和層析Ni柱純化蛋白，得到高純度蛋白質可以與碳點通過脫水縮合反應結合，構建生物熒光傳感器，用于檢測樣品中（1，3）-β-D葡聚糖的含量。當特異性蛋白質與碳點結合物濃度固定時，樣品的熒光值的增加量在一定范圍內與樣品所含βG量呈正相關。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

本實驗用的實驗儀器包括：Synergy2熒光酶標儀（美國BioTek公司）；96孔微孔黑板（美國Corning公司）；RF-5301PC熒光分光光度計（日本島津公司）；HZQ-F160全溫振蕩培養箱（哈東聯公司）；Tecnai G2 20透射電鏡（美國FEI公司）。

本實驗用的實驗試劑包括：工程菌E.coli BL21-pET-15b-Gαa（上海生物工程有限公司構建）；氨基修飾的碳點（蘇州大學贈予）；（1，3）-β-D葡聚糖標準品（購自上海源葉生物有限公司）；IPTG、N-乙基-N’-（3-二甲基氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）（購自Sigma-Aldrich）；其余試劑均為國產分析純。

1.2 重組菌的表達純化和純化

根據GenBank：AB547712.1上登記的美洲鱟屬G因子α亞基片段a（Gαa）的基因序列，大小是1251bp，合成 BL21-pET-15b-Gαa的工程菌。將含有重組質粒的E.coli BL21菌株接種到LB液體培養液中表達，表達條件是20℃，160rpm，LB培養基中加入IPTG至終濃度為1mM，培養48小時。培養后，將培養液進行離心分離，回收所得的沉淀物（菌體）。將沉淀物用PBS洗滌2次，然后用NPI-1（PBS，含有咪唑1 mmol/L，pH 7.4）重懸菌體，加入溶菌酶，通過反復凍融和超聲破碎，離心取上清。過Ni柱時按照上海悅克生物科技有限公司的Ni-NTA親和層析柱的說明書純化目的蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

1.3 碳點性質

用透射電鏡掃描碳點，觀察碳點的形貌和大小。

用熒光分光光度計，檢測1mL的碳點，在不同的激發波長下，觀察熒光光譜的變化，最終找到規律并選出最佳的激發波長。

將碳點按照體積梯度稀釋，在紫外照射下用肉眼觀察樣品熒光光強的變化。用熒光分光光度計，輸入最佳的激發波長，得到的熒光峰值，用峰值繪制曲線，研究熒光碳點的水溶性和均一性。

1.4 生物熒光傳感器的制備及檢測方法

用紫外可見分光光度計測量蛋白的濃度，用PBS緩沖溶液配制Gαa蛋白濃度為2.0mg/mL，用量6mL，加入5μL的EDC，在37℃下反應30min，活化蛋白中的-COOH。用超濾離心管離心，將多余的EDC除去，然后加入2mL的碳點（-NH4修飾），37℃下反應3h，制備成檢測真菌感染時（1，3）-β-D葡聚糖含量的生物熒光傳感器。

檢測原理是，利用碳點上帶有的-NH4與Gαa蛋白中-COOH發生脫水縮合反應，即將Gαa蛋白連在碳點上；加入待檢測物（1，3）-β-D葡聚糖，βG可與Gαa蛋白特異性氨基酸序列結合，從而進一步增加碳點的的體積；而碳點的熒光強度會隨著待測物濃度的上升而出現熒光峰值上升的現象。通過分析熒光峰值上升程度與βG濃度之間關系，可以獲得βG檢測標準曲線，進而可以檢測溶液中的Gαa蛋白濃度。

為了保證碳點熒光的穩定性，研究在不同溫度、反應時間、pH值和在25mM Mg2+用量條件下對反應的影響，根據反應曲線最終確定最佳反應條件。

在96孔黑板中加入200μL生物熒光傳感器和30μL用蒸餾水梯度稀釋的（1，3）-β-D葡聚糖標準品，加入6μL Mg2+，在溫度37℃下反應10min，放入熒光酶標儀中，輸入最佳激發波長和檢測參數，檢測熒光強度。設定含有（1，3）-β-D葡聚糖的樣品熒光光強與空白對照熒光光強之差為傳感器響應值（熒光值），繪制標準曲線。

1.5 方法學評估

對所建立的方法進行了批間、批內精密度實驗、準確度（回收率）實驗和穩定性實驗。

2 實驗結果

2.1 重組目的菌的表達及純化

對重組工程菌采用IPTG誘導，使其表達Gαa蛋白，過Ni柱純化蛋白，向Ni柱中依次加入，BL21-pET-15b-Gαa總蛋白、NPI-1、NPI-20（PBS，含有咪唑 20mmol/L，pH 7.4）、NPI-30（PBS，含有咪唑 30mmol/L，pH 7.4）和 NPI-200（PBS，含有咪唑200mmol/L，pH 7.4），收集流出樣，經過SDS-PAGE鑒定，結果如蛋白電泳圖1所示，6號條帶為純化后的Gαa蛋白，純化產物在約40kDa處有一條明顯表達帶，與預期蛋白分子量相符，Gene Tools軟件分析結果顯示純化后Gαa蛋白含量達到85%。

圖1 Gαa蛋白誘導表達及純化SDS-PAGE電泳

2.2 碳點表征

用透射電鏡掃描碳點，結果如圖2所示，得到其大小在1nm-10nm之間，符合正態分布，碳點的大小居中在5nm。說明該氨基修飾碳點均一性較好，可用于后續試驗。

圖2 TEM對碳點的表征

2.3 碳點的熒光強度曲線

用熒光分光光度計檢測碳點在不同激發波長340nm～400nm下的熒光光譜變化，最終找到最佳的激光波段，如圖3所示，在360nm波長的激發下，熒光發射光強在430nm時可達到最高值。當激發波長發生變化時，碳點的熒光光譜出現了紅移或是藍移現象，熒光峰值也隨之變化。

圖3 在不同波長激發下的熒光光譜

2.4 碳點的溶解性和均一性

將碳點用蒸餾水進行5次稀釋，稀釋比例分別為1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。對溶液進行紫外光照射，觀察溶液發射的熒光光強變化，如圖4左上方所示，碳點在紫外光下照射發出藍色的熒光，熒光光強隨著碳點的梯度稀釋而減弱。

用熒光分光光度計，檢測不同濃度的碳點，在檢測儀器中輸入最佳激發波長360nm，檢測熒光光強的峰值并繪制曲線。如圖4所示，X軸為碳點的相對濃度，Y軸為最高熒光強度值，曲線R2=0.999，說明碳點的水溶性和均一性良好。

圖4 不同濃度碳點的熒光強度變化

2.5 實驗原理圖

碳點-Gαa蛋白熒光生物傳感器檢測（1，3）-β-D葡聚糖原理如圖5所示，氨基修飾碳點與Gαa蛋白羧基進行脫水縮合反應，合成熒光生物傳感器，該傳感器上的蛋白質可與待檢測樣品中βG特異性結合，待反應結束后熒光傳感器在激發光波長為360nm處進行激發，檢測發射光熒光光譜。結果顯示在470nm處出現峰值，且隨著βG濃度增加，熒光光譜峰值也隨之增加。

圖5 實驗原理

2.6 反應條件的摸索

圖6 反應條件的研究

對不同溫度、pH值、反應時間、和25mM Mg2+的用量對實驗反應數據的影響進行了實驗摸索。結果如圖6所示，圖6（a）為對反應溫度的摸索，當溫度從10℃增加到60℃時，可知37℃為最佳反應溫度；圖6（b）為對溶液pH的摸索，溶液pH值在4～9的反應體系時，可知偏中性pH=6.8為最佳反應pH；圖6（c）為對反應時間的摸索，當時間從0min增加到60min時，從圖可知10min為最佳反應時間；圖6（d）為25mM Mg2+的用量摸索，當用量從0μL增加到12μL時，從圖可知6μL為最佳反應用量。

2.7 （1，3）-β-D葡聚糖標準熒光曲線

在黑色的酶標板中加入200μL生物熒光傳感器和30μL用蒸餾水稀釋的βG，加入6μL的25mM Mg2+，在溫度37℃下反應10min，用熒光酶標儀在360nm激發，470nm檢測溶液發射的熒光光強。將測得的熒光值繪制成標準曲線，結果如圖7所示，X軸為βG濃度，Y軸為實測熒光值減去空白熒光值，線性范圍是9.375-150pg/mL。對βG標準品進行梯度稀釋進行檢測，測得最低檢測限為9.375pg/mL。

圖7 不同濃度的βG在生物熒光傳感器中的熒光強度

2.8 方法學的評估

做5組平行實驗，對所建立的方法進行了批間、批內精密度、準確度（回收率）和穩定性測定。結果如表1所示，批間和批內的變異系數均小于5%，準確度（回收率）在97%～102%之間，在7天內，生物熒光傳感器保持穩定。

表1 實驗方法學的評估

3 結論

本文表達了與（1，3）-β-D葡聚糖特異性結合的美洲鱟G因子α亞基片段a（Gαa）蛋白，蛋白質量為40kDa，濃度為2mg/mL。氨基化修飾碳點平均直徑5nm，具有良好的水溶性和均一性。文中采用EDC/NHS氨基與羧基脫水縮合反應，將Gαa蛋白與碳點偶聯，構建了定量檢測（1，3）-β-D葡聚糖的生物熒光傳感器，并對該熒光檢測方法進行優化，熒光強度與（1，3）-β-D葡聚糖濃度呈正線性相關，檢測標準曲線y=10.697x+148.52，R2=0.993，檢測下限9.375pg/mL。該方法批間和批內變異系數CV均小于5%，準確度（回收率）在97%～102%之間。

市售βG測定試劑盒均采用天然鱟血作為檢測試劑，鱟屬于二級保護動物，因此該方法不僅成本高，而且易出現資源枯竭，長期將對生態環境的穩定造成破壞。本文原核表達了（1，3）-β-D葡聚糖特異性結合美洲鱟G因子α亞基片段a（Gαa）蛋白，與氨基化碳點偶聯，建立了熒光傳感檢測方法，能夠實現（1，3）-β-D葡聚糖的定量檢測，無需采集天然珍惜鱟血作為試劑，在降低檢測成本的同時，保護了野生生物資源。采用酶標板可以實現高通量96個樣本的檢測，節約大量人力物力。本方法對（1，3）-β-D葡聚糖的檢測下限為9.375pg/mL，優于市售（1，3）-β-D葡聚糖測定試劑盒的11pg/mL，達到國家標準。因此，建立的生物熒光傳感器定量檢測（1，3）-β-D葡聚糖的方法具有高靈敏、高特異性、快速、高通量、低成本的特點，具有廣泛的應用價值。

［1］Liao WQ，Gu JL.Current situation of and countermeasures to antifungal agent resistance［J］.Pharmaceutical Care and Research，2006（3）：917-922.

［2］田振華.（1，3）-β-D葡聚糖的檢測方法學研究［D］.長春：長春理工大學，2016.

［3］De Pauw B，Walsh TJ，Donnelly JP，et al.Revised definitions of invasive fungal disease from the European organization for research and treatment of cancer/invasive fungalinfectionscooperative group and the national institute of allergy and infectious diseases mycoses study group［J］.Consensus Group.Clin Infect Dis，2008（46）：1813-1821.

［4］Kedzierska A，KochanP，Pietrzyk A，et al.Current status of fungal cell wall components in the immunodiagnostics of invasive fungal infections in humans：galactomannan，mannan and（1→3）-β-D-glucan antigens［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2007（26）：755-766.

［5］Odabasi Z，Mattiuzzi G，Estey E.Beta-D-glucan as a diagnostic adjunct for invasive fungal infections：validation，cutoff development，and performance in patients with acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndrome［J］.Clin Infect Dis，2004，39（2）：199-205.

［6］Mokaddas E，Khan Z U，Ahmad S，et al.Value of（1-3）-beta-glucan，candida mamman and candida DNA detection in the diagnosis of candidaemia［J］.ClinMicrobiol Infect，2011，17（10）：1549-1553.

［7］Shimizu A，Oka H，Matsuda T，et al.（1-3）-betaglucan is a diagnostic and negative prognostic marker for pneumocystis carinii pneumonia in patients with connective tissue disease［J］.ClinExpRheumatol，2005，23（5）：678-680.

［8］Persat F，Ranque S，Derouin F，et al.Contribution of the（1-3）-beta-glucan assay for diagnosis of incasive fungal infections［J］.ClinMicrobiol，2008，46（3）：1009-1013.

［9］Pickering JM，Sant HW，Bowles C A，et al.Evaluation of a（1-3）-beta-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections［J］.ClinMicrobiol，2005，43（12）：5957-5962.

［10］Weng ZH，Hong SG.The Distribution and Habit of Horseshoe Crabs［J］.Chinese Journal of Zoology，2001（05）：621-626.

［11］金剛，蔡國平.中國鱟血細胞原代培養及部分生物學現象觀察［J］.水生生物學報，2008，32（5）：770-773.

［12］Manman Yang，Hao Li，Juan Liu，et al.Convenient and sensitive detection of norfloxacin with fluorescent carbon dots［J］.Journal of Materials Chemistry B，2014（2）：7964-7970.

［13］Hao Li，Weiqian Kong，Juan Liu，et al.Carbon dots for photoswitching enzyme catalytic activity［J］.Journal of Materials Chemistry B，2014（2）：5652-5658.

［14］Hao Li，Juan Liu，Manman Yang，et al.Highly sensitive，stable，and precise detection of dopamine with carbon dots/tyrosinase hybrid as fluorescent probe［J］.RSC Advances，2014（4）：46437-46443.

A High Selective and Specific Fluorescent Test Method for The Detection of（1，3）-β-D-Glucan

GE Yuxin1，ZHANG Yang2，TIAN Zhenhua2，YU Yuanhua2，GUO Rui2，ZHANG Hao2
（1.Hospital of Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

The concentration of（1，3）-beta-D glucan（βG）in human serum is a clinical testing index of invasive fungal infection，a beta-glucan binding protein of horseshoe crab（limulus polyphemus）factor G-subunit α fragment-a（Gαa）was expressed in Escherichia coli BL21，Coupling of amination retouching carbon dots with G protein and establishing a“carbon dots/Gαa protein”fluorescent sensor for βG detection.The sensor excitation wavelength was 360 nm，emission wavelength was 460nm.The fluorescent and the concentration of βG were a positive linear correlation.，the detection range was 9.375～150pg/mL，the limit of detection was 9.375 pg/mL.The CV values within batch and between batches were all less than 5%，accuracy（recovery） were between 97%～102%.The novel fluorescent sensor for the detection of βG was low cost，rapid，high selective，sensitivity and specificity.

（1，3）-β-D-glucan；Gαa protein；carbon dots；fungus.

O613.71

A

1672-9870（2017）04-0133-05

2017-04-17

吉林省科技廳資助項目（20140309013YY）

葛宇新（1971-），女，本科，主管護士，E-mail：837349751@qq.com