非小細胞肺癌中TAMs、Ki-67的表達及預后意義

魏宇森，楊龍飛，張小陸，張洪珍，2*

(1.河北醫科大學研究生學院，河北 石家莊 050017；2.河北省人民醫院腫瘤五科，河北 石家莊 050051)

·論著·

非小細胞肺癌中TAMs、Ki-67的表達及預后意義

魏宇森1，楊龍飛1，張小陸1，張洪珍1，2*

(1.河北醫科大學研究生學院，河北 石家莊 050017；2.河北省人民醫院腫瘤五科，河北 石家莊 050051)

目的探討腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)、腫瘤增殖因子(Ki-67)在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表達及其與臨床病理特征的關系，并研究其與預后的關系。方法采用免疫組織化學SP法檢測68例NSCLC組織和17例癌旁正常肺組織中CD68(TAMs表面標志) 、Ki-67的表達情況。根據隨訪結果，應用Kaplan-Meier 生存分析和Cox回歸法分析CD68、Ki-67與肺癌預后的關系。結果CD68、Ki-67在68例肺癌組織中的陽性率分別為66.2%(45/68)、61.8%(42/68)，在正常肺組織中的陽性表達率分別為17.6%(3/17)、5.9%(1/17)，差異均有統計學意義(P<0.05)。CD68、Ki-67在高TNM 分期、淋巴結轉移、侵及胸膜的NSCLC 組織中的表達明顯著增高(P<0.05)。低分化者Ki-67的表達明顯增高(P<0.05)。NSCLC中CD68與Ki-67的表達呈正相關(r=0.461，P=0.000)。68例NSCLC患者1、3、5年生存率分別為86.76%、64.71%、16.18%。Cox多因素分析顯示，分化程度低和淋巴結轉移是預后不良的危險因素(P<0.05)。結論CD68、Ki-67陽性肺癌患者預后差。CD68、Ki-67在NSCLC的發展、浸潤、轉移中起一定作用，聯合檢測可作為臨床診斷、輔助治療的潛在靶點。

癌，非小細胞肺；腫瘤相關巨噬細胞；細胞增殖因子

腫瘤的復發、轉移已成為影響肺癌患者生存期的重要原因。腫瘤相關巨噬細胞(tumorassociatedmacrophages，TAMs)是浸潤在腫瘤組織中的巨噬細胞，是腫瘤微環境中最多的免疫細胞，可以分泌多種細胞因子，在腫瘤發生初期能夠識別并清除腫瘤細胞，但隨著腫瘤的發生發展，又對腫瘤的生長、侵襲、轉移起著關鍵作用。在腫瘤的發生發展中TAMs發揮著“雙刃劍”的作用。CD68是常見的巨噬細胞標志物[1]。Ki-67是反映細胞增殖活性的指標，與腫瘤的發展、轉移及預后存在密切的關系[2]。本研究采用免疫組織化學SP法檢測非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)組織中CD68、Ki-67的表達，分析其表達與臨床病理特征的關系，進而探討二者對NSCLC發生、發展、預后的影響。

1 資 料 與 方 法

1.1 一般資料 選取2009年12月—2013年12月經河北省人民醫院胸外科手術切除、有明確組織學病理診斷的68例NSCLC患者組織蠟塊。另收集17例癌旁正常肺組織行對照研究。17例正常肺組織中男性12例，女性5例，年齡45～73歲，中位年齡61歲。68例NSCLC患者中男性50例，女性18例，年齡48～79歲，中位年齡65歲；病理類型：腺癌32例，鱗癌26例，其他類型癌10例；分化程度：高分化17例，中分化30例，低分化21例；有淋巴結轉移者43例，無淋巴結轉移者25例；TNM病理分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期20例，Ⅲ期39例。

研究中涉及的蠟塊標本和臨床資料均已征得患者家屬同意，并報醫院倫理委員會審查通過。

1.2 主要試劑 兔抗人Ki-67單克隆抗體購自美國Bioworld公司，鼠抗人CD68單克隆抗體、SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學SP法 切片常規脫蠟至水，抗原修復，置入3%H2O2室溫孵育15min，滴加一抗，置于試劑盒中4℃過夜；PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育30min；PBS沖洗后DAB顯色，洗滌，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹脂膠封片，鏡下觀察。陽性對照：Ki-67選擇人乳腺癌陽性片，CD68選擇人肝癌陽性片；陰性對照：用PBS代替一抗。

1.4 結果判定 染色后所有切片由病理科醫生和研究者按雙盲法進行讀片并判斷結果：CD68 標記的TAMs以細胞漿呈現棕黃色為陽性表達，判定標準[3]：在高倍鏡下觀察5個視野計數CD68陽性的巨噬細胞數目得平均值為最后結果。根據陽性表達數目分為2組，TAMs≤60個/HP為低表達組，TAM>60個/HP為高表達組。Ki-67以細胞核呈棕黃色顆粒為陽性表達，判斷標準[4]：陽性指數>20%直接判定為陽性，陽性指數<15%為低表達，陽性指數≥15%為高表達。

1.5 生存指標 出院后每3個月隨訪1次。無進展生存期(progression-freesurvival,PFS)定義為手術治療后至疾病進展或未進展死亡的時間。總生存期(overallsurvival,OS)定義為手術治療后至死亡或末次隨訪時間。

1.6 統計學方法 應用SPSS21.0軟件對數據進行統計學分析。計數資料比較采用χ2檢驗；相關性采用Spearman等級相關分析；生存期比較采用Kaplan-Meier法；危險因素確定采用Cox回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CD68、Ki-67在正常肺組織和NSCLC組織中的表達CD68在正常肺組織和NSCLC組織中陽性表達率分別為17.6%和66.2%，其差異有統計學意義。Ki-67在正常肺組織和NSCLC組織中陽性表達率分別為5.9%和61.8%，其差異有統計學意義(P<0.05)。 見表1和圖1，2。

2.2 不同臨床和病例特征NSCLC組織中CD68、Ki-67表達 不同性別、年齡、組織學類型及分化程度患者CD68陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)；TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉移、侵及胸膜患者CD68陽性表達率高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移和無侵及胸膜患者，差異有統計學意義(P<0.05)。不同性別、年齡及組織學類型患者Ki-67陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)；低分化程度、TNM分期Ⅲ期、有淋巴結轉移和侵及胸膜患者Ki-67陽性表達率高于高分化和中分化程度、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移和無侵及胸膜患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 CD68、Ki-67在正常肺組織和NSCLC組織中的表達Table 1 Expression of CD68 and Ki-67 in normal lung tissues and NSCLC tissues (例數，%)

圖1 CD68在NSCLC組織中的陽性表達(SP ×100)

Figure1ThepositiveexpressionofCD68inNSCLCtissues(SP×100)

圖2Ki-67在NSCLC組織中的陽性表達(SP×100)

Figure2ThepositiveexpressionofKi-67inNSCLCtissues(SP×100)

表2 NSCLC組織中CD68、Ki-67表達與臨床和病理特征之間的關系Table 2 Relationship of expression of Ki-67 and CD68 with clinical pathological features in NSCLC tissues (例數，%)

*P<0.05與低分化比較(χ2檢驗)

2.3 NSCLC組織中CD68、Ki-67表達的相關性 Spearman相關分析顯示，68例NSCLC組織中CD68與Ki-67的陽性表達呈正相關(P=0.000)，見表3。

2.4 NSCLC組織中CD68、Ki-67表達對生存期的影響 68例NSCLC中位生存時間為37.5個月，1、3、5年生存率分別為86.76%、64.71%、16.18%，見圖3，4。

表3 NSCLC組織中Ki-67和CD68表達的相關性Table 3 Correlation between expression of Ki-67 and CD68 in NSCLC tissues (例數)

2.5 Cox回歸分析 分別以OS和PFS為因變量，以分化程度、TNM分期和淋巴結轉移為自變量，進行Cox回歸分析，結果顯示低分化程度和有淋巴結轉移是OS和PFS生存預后不良的獨立危險因素(P<0.05)，見表4，5。

表4 OS多因素生存分析Table 4 Multivariate analysis of OS

表5 PFS多因素生存分析Table 5 Multivariate analysis of PFS

2.6 CD68、Ki-67表達與NSCLC患者生存率的關系 所有患者均隨訪至2016年12月31日，死亡57例，存活11例。Kaplan-Meier法生存分析顯示，68例NSCLC中CD68表達陽性患者OS和PFS明顯低于CD68表達陰性患者(P<0.05)，Ki-67表達陽性患者OS和PFS明顯低于Ki-67表達陰性患者(P<0.05)，見圖5～8。

圖3 68例NSCLC患者OS生存曲線

Figure3TheOScurveof68casesofpatientswithNSCLC

圖4 68例NSCLC患者PFS生存曲線

Figure4ThePFScurveof68casesofpatientswithNSCLC

圖5NSCLC患者中CD68表達水平與OS生存曲線關系

Figure5Kaplan-MeiersurvivalcurvesofOSaccordingtoCD68levelinNSCLCpatients

圖6NSCLC患者中CD68表達水平與PFS生存曲線關系

Figure6Kaplan-MeiersurvivalcurvesofPFSaccordingtoCD68levelinNSCLCpatients

圖7NSCLC患者中Ki-67表達水平與OS生存曲線關系

Figure7Kaplan-MeiersurvivalcurvesofOSaccordingtoKi-67levelinNSCLCpatients

圖8NSCLC患者中Ki-67表達水平與PFS生存曲線關系

Figure8Kaplan-MeiersurvivalcurvesofPFSaccordingtoKi-67levelinNSCLCpatients

3 討 論

腫瘤的發生發展不但與腫瘤細胞有關，還與腫瘤細胞存在的內環境(即腫瘤微環境)密不可分。腫瘤微環境又分為免疫微環境、炎癥微環境、缺氧微環境等。不同的微環境決定了巨噬細胞不同的活化類型，通常可分為M1型和M2型。前者稱為經典活化型，可參與Th1型免疫應答，具有促進炎癥反應、吞噬腫瘤細胞、保護機體的作用。后者又被稱為替代活化型，參與Th2型免疫應答，其抗感染作用較弱，與腫瘤微血管形成有關，并促進腫瘤進展。腫瘤細胞可產生多種巨噬細胞趨化性因子，趨化外周循環中的單核細胞進入腫瘤組織，在腫瘤微環境誘導下分化為特定的表型。TAMs的生物學特性類似于M2型巨噬細胞[5]，既是免疫抑制細胞的主要成員之一，又是腫瘤炎癥微環境的重要組成部分[6]，參與并促進了腫瘤的發生、發展，并介導免疫逃逸。付玉等[7]研究發現，TAMs通過分泌表皮生長因子和肝細胞生長因子等多種生長因子促進腫瘤生長和增殖。CD68是TAMs的分子標志物之一。本研究結果顯示，NSCLC組織中CD68陽性表達率顯著高于正常肺組織，且CD68的表達與TNM分期、淋巴結轉移、侵及胸膜有關。表明腫瘤的炎癥浸潤中存在大量的巨噬細胞，NSCLC微環境中的CD68可能參與了NSCLC的發生、發展過程。這與Almatroodi等[8]的研究報道一致。本研究生存分析顯示，CD68陰性表達的NSCLC患者生存時間明顯長于CD68陽性表達患者(P<0.05)，即CD68表達越高，預后越差。這與多種實體腫瘤如胃癌、肝癌、星形膠質瘤中CD68高表達與生存期短呈正相關研究結果一致[9-11]。

Ki-67是增殖細胞核基質內抗原的一種，是目前較肯定的核增殖標志物[12]。Ki-67的表達影響著細胞的增殖周期，在G0期不表達，而在G1、G2、S、M期均有表達，尤以 G2期和M期表達最強，一旦增生期結束，細胞內表達的Ki-67會迅速降解[13]。因此，Ki-67可作為評估NSCLC[14]、乳腺癌[15]、前列腺癌[16]、基底細胞癌[17]等惡性腫瘤增殖的標志物。韓影等[18]發現，NSCLC中Ki-67與血管內皮生長因子表達密切相關，可作為肺癌生長、轉移的一個可靠的生物學指標。本研究結果顯示，Ki-67在NSCLC中的表達與組織分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關(P<0.05)。表明Ki-67高表達是判斷惡性腫瘤預后的一個有價值的指標。本研究生存分析顯示，Ki-67陰性表達的NSCLC患者生存時間明顯長于Ki-67陽性表達患者(P<0.05)。表明Ki-67陽性表達患者生存期較短，預后較差。本研究還顯示分化程度、淋巴結轉移是預后的獨立因素。表明分化程度越低、有淋巴結轉移，患者預后越差。

本研究結果顯示CD68與Ki-67表達呈正相關性，表明在NSCLC患者中CD68陽性TAMs浸潤可能促進了肺癌細胞的增殖。這與邢洲等[11]研究結果相似。有研究認為，腫瘤及其相關介質細胞可分泌多種趨化因子和細胞因子如單核細胞趨化蛋白1、集落刺激因子1等[19]，可將巨噬細胞招募至腫瘤組織并誘導其向TAMs轉化。TAMs可釋放多種物質，誘導血管形成，進而促進腫瘤生長，即導致Ki-67高表達。本研究聯合檢測 CD68與Ki-67的表達情況，結果顯示二者均過表達的患者其生存期更短。表明聯合檢測CD68與Ki-67蛋白表達水平可能會更好地預測NSCLC患者的預后。

綜上所述，TAMs、Ki-67均參與了NSCLC的整個發生、發展過程，二者聯合檢測可作為臨床診斷、輔助治療的潛在靶點。

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(本文編輯：許卓文)

ExpressionandprognosticsignificanceofTAMsandKi-67innonsmallcelllungcancer

WEIYu-sen1，YANGLong-fei1，ZHANGXiao-lu1，ZHANGHong-zhen1，2*

(1.GraduateSchoolofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China; 2.The5thDepartmentofOncology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

ObjectiveTo investigate the expression levels of tumor associated macrophages(TAMs), tumor proliferation factor(Ki-67) in non-small cell lung cancer(NSCLC) and their relationships with the clinical pathological features, and to study its relationship with prognosis.MethodsImmunohistochemical SP method was used to analyze the expressions of CD68(TAMs surface marker) Ki-67 and in 68 cases of NSCLC tissues and 17 cases of normal lung tissues. According to the results of follow-up, Kaplan-Meier survival analysis and Cox regression analysis of CD68, Ki-67 was used to study its relationship with lung cancer prognosis.ResultsThe positive rates of CD68 and Ki-67 in 68 cases of lung cancer were 66.2%(45/68) and 61.8%(42/68). The positive expression rates of CD68 and Ki-67 in normal lung tissues were 17.6%(3/17) , 5.9%(1/17), the difference was statistically significant(P<0.05). The expression of CD68 and Ki-67 in NSCLC tissues with high TNM stage, lymph node metastasis and invasion were significantly increased(P<0.05).In addition, the expression of Ki-67 in poorly differentiated patients increased. There was a positive correlation between CD68 and Ki-67 expression in NSCLC(r=0.461,P=0.000). Sixty-eight patients with NSCLC 1, 3, 5-year survival rate were 86.76%, 64.71%, 16.18%. Cox multivariate analysis showed that the low degree of differentiation and lymph node metastasis are risky factors for adverse prognosis(P<0.05).ConclusionCD68, Ki-67-positive lung cancer patients with poor prognosis. CD68 and Ki-67 play a role in the development, invasion and metastasis of NSCLC, and combined detection of them provide a potential target for clinical diagnosis, adjuvant therapy of NSCLC.

carcinoma,non-small-celllung;tumorassociatedmacrophages;Ki-67

R734.2

A

1007-3205(2017)10-1135-06

2017-04-18；

2017-05-11

河北省醫學科學研究重點課題計劃(ZD20140479)

魏宇森(1990-)，男，河北石家莊人，河北醫科大學研究生學院醫學碩士研究生，從事惡性腫瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail:hognzhenzhang456@sohu.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.10.005