慢性缺氧應激可能通過EMT增強乳腺癌MCF-7細胞惡性生物學行為*

陳 堅， 何詠竟， 汪思應， 胡 敏

(1安徽中醫藥大學， 安徽 合肥 230038； 2廈門大學第一附屬醫院超聲科， 福建 廈門 361001； 3安徽醫科大學， 安徽 合肥 230032)

慢性缺氧應激可能通過EMT增強乳腺癌MCF-7細胞惡性生物學行為*

陳 堅1,2， 何詠竟3， 汪思應3， 胡 敏1△

(1安徽中醫藥大學， 安徽 合肥 230038；2廈門大學第一附屬醫院超聲科， 福建 廈門 361001；3安徽醫科大學， 安徽 合肥 230032)

目的探討慢性缺氧應激對人乳腺癌MCF-7細胞惡性生物學行為的影響及可能機制。方法將人乳腺癌MCF-7細胞分為缺氧組(1% O2、5% CO2和94% N2)和正常對照組(常氧)進行培養。利用MTT法、CCK-8實驗、細胞直接計數法及細胞侵襲和遷移實驗對MCF-7細胞活力、增殖及侵襲和遷移能力進行檢測；用軟瓊脂集落形成實驗及Matrigel 3D培養技術檢測MCF-7細胞非錨定生長能力及極性改變情況；利用MCF-7細胞構建裸鼠皮下種植瘤模型，檢測慢性缺氧應激對體內腫瘤生長及肺轉移的影響；利用倒置顯微鏡觀察MCF-7細胞形態改變；Western blot檢測低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和磷酸化的糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)在缺氧環境下表達水平的改變，以及E-鈣黏連蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏連蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、MMP-9等上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關蛋白的表達水平。結果與正常對照組相比較，慢性缺氧組MCF-7細胞活力、增殖能力及侵襲遷移能力增強，細胞非錨定生長能力提高且在3D培養系統更容易發生極性改變，呈現侵襲樣生長，體內生長及轉移能力增強;除了HIF-1被缺氧誘導表達升高外，GSK-3β呈現活化趨勢，且上皮樣標志物E-cadherin蛋白表達水平明顯下降，而間充質樣標志物N-cadherin、vimentin、MMP-3和MMP-9蛋白表達水平明顯升高。結論慢性缺氧應激促進了乳腺癌細胞惡性生物學行為，且其機制可能與EMT有關。

乳腺癌； 缺氧； 腫瘤轉移； 腫瘤微環境； 上皮-間充質轉化

乳腺癌發病率在經濟發達地區居于女性惡性腫瘤的首位[1]，以手術為主的綜合治療雖然取得較好的臨床療效，但浸潤和轉移仍舊是影響患者生存率和死亡率的主要因素[2]。促進乳腺癌轉移的潛在分子機制目前尚不清楚。由于腫瘤細胞快速增殖而相應的血管網絡不能及時建立，且新生血管在結構上存在異常，腫瘤缺氧微環境是人類惡性實體腫瘤的基本特征之一[3]。局部微環境缺氧可以對腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移等惡性生物學行為的發生產生顯著影響[4]。闡明乳腺癌惡性生物學行為與腫瘤缺氧微環境的關系，進而明確其在腫瘤惡性進展過程中發揮重要作用的關鍵分子，尋找其相對應的靶點，對于提高乳腺癌的生存率具有重要的作用。本文通過體內及體外實驗研究，觀察慢性缺氧應激對人乳腺癌MCF-7細胞惡性生物學行為的影響，并探究其機制是否與上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關。

材 料 和 方 法

1動物及細胞

SPF 級 BALB/c-nu裸鼠24只，雌性，6周齡，體重15～21 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SCXK(京)2014-0004。人乳腺癌MCF-7細胞購自中科院上海細胞生物所細胞庫，本實驗室凍存。

2主要試劑

DMEM高糖培養基、胰酶和小牛血清購于Gibco；1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素購于HyClone；MTT細胞活力試劑盒購于KeyGEN Biotech；三(羥甲基)氨基甲烷、丙烯酰胺、過硫酸銨和十二烷基硫酸鈉購于上海生工生物公司；蛋白酶抑制劑購于Roche； Transwell小室購于BD；瓊脂糖粉劑購自Biowest；蛋白印跡化學發光檢測試劑盒購于北京康為世紀生物有限公司；抗低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)、抗糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)、抗E-鈣黏連蛋白(E-cadherin)、抗N-鈣黏連蛋白(N-cadherin)、抗波形蛋白(vimentin)、抗基質金屬蛋白酶3(matrix me-talloproteinase-3, MMP-3)、抗MMP-9和抗β-actin抗體均購于Abcam； HRP偶聯的山羊抗鼠Ⅱ抗購于Proteintech。

3主要方法

3.1細胞培養及分組 人乳腺癌MCF-7細胞分為正常對照組(常氧培養)和缺氧組，用含有10%小牛血清、1% 青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養基進行培養。將正常對照組置于37 ℃、95% O2、5% CO2、飽和濕度條件下的CO2細胞培養孵箱內進行培養；缺氧組置于37 ℃、1% O2、5% CO2、94% N2的三氣培養箱內進行缺氧培養。

3.2細胞形態觀察 取對數生長期細胞制成單細胞懸液，調整濃度為2×107/L，把細胞懸液按每孔150 μL接種于96孔板，每組設置6個復孔。將細胞置于細胞培養箱中分別進行常氧或者缺氧培養，并于培養0 h、12 h、24 h、36 h、48 h及60 h后在倒置相差顯微鏡下對腫瘤細胞形態進行觀察、拍照。

3.3MTT實驗 取對數生長期細胞制成單細胞懸液，調整濃度為2×107/L，把細胞懸液按每孔150 μL接種于96孔板，每組設置6個復孔。分別進行常氧或缺氧培養(0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h)后進行MTT實驗對細胞活力進行檢測。每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL，常規培養4 h后，將孔內的培養液吸出，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，孵育15 min，利用酶標儀對490 nm 處各孔的吸光度(A)進行檢測。

3.4CCK-8實驗 取對數生長期細胞制成單細胞懸液，調整濃度為2×107/L，把細胞懸液按每孔150 μL接種于96孔板，每組設置6個復孔。分別進行常氧或缺氧培養(0 h、12 h、24 h、36 h和48 h)后進行CCK-8實驗，對細胞活力進行檢測。每孔加入10 μL CCK-8置于37 ℃培養箱孵育2 h，利用熒光分光光度計對450 nm 處各孔的吸光度(A)進行檢測。

3.5直接計數法 將2×104個細胞接種于24 孔培養板(每組設4復孔，取均值)，分別進行常氧或缺氧培養(0 h、12 h、24 h、36 h和48 h)后，用3 mL 0.25% 胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液進行消化，取細胞懸液用細胞計數器進行計數，對細胞增殖能力進行檢測。 實驗重復3次。

3.6Transwell侵襲和遷移實驗 將100 μL的50 mg/L Matrigel用稀釋液1∶40稀釋，均勻涂于Transwell小室底膜的上室面，4 ℃晾干。取對數生長期細胞消化后重懸，并調整細胞濃度至2×107/L。將Matrigel包被的Transwell小室小心放入24孔板(在放置小室時確保小室底層薄膜和培養液之間沒有氣泡)，水化后，在小室下層加入含10%血清的DMEM完全培養基，細胞懸液按每孔200 μL接種于小室的上室。分別進行常氧或者缺氧培養36 h 后收24孔板，吸棄上清液，并用PBS清洗2 次，然后用40 g/L多聚甲醛固定,隨后0.1%結晶紫染色30 min。染色結束后，清洗脫色，用棉簽輕拭上室殘余細胞，室溫干燥后置于倒置顯微鏡下進行觀察，每孔隨機選取5個視野的細胞進行計數并拍照、統計分析。細胞遷移實驗無需預先進行Matrigel包被，其余步驟同侵襲實驗。

3.7軟瓊脂集落形成實驗 將含有0.5%底層瓊脂、20% 胎牛血清的RPMI-1640培基充分混勻，按每孔1 mL加入6孔板中，室溫凝固備用。取對數期生長細胞制成單細胞懸液，調整濃度為2×107/L，加至鋪有底層瓊脂的6孔板中，每孔1 mL，每組細胞設3個復孔。分別進行常氧或者缺氧培養連續培養 2周。于倒置顯微鏡下進行觀察，統計集落形成數。

3.8Matrigel 3D培養實驗 在3.6的實驗基礎上，將小室預先用Matrigel基質膠進行包被。將稀釋好的Matrigel膠均勻鋪于小室底部(所有操作均在冰上進行)，37 ℃培養箱內凝固30 min后用于實驗。

3.9裸鼠成瘤實驗 常規消化正常對照組和缺氧組對數生長期的MCF-7細胞，用無血清培養基將細胞調整為密度為1×1011/L的細胞懸液。分別將2組細胞懸液注射于裸鼠腋窩處皮下，每只注射0.2 mL，接種細胞數為2×107個。注射后觀察腫瘤生長情況，分別于接種后的5、12、15、18、21和24 d用游標卡尺測量每只小鼠腋下腫瘤長徑(a)和短徑(b)，并計算腫瘤體積，計算公式為：腫瘤體積(mm3)=1/2×a×b2，繪制腫瘤生長曲線。4周后小鼠脫頸椎處死，留取腫瘤組織及肺組織。觀察肺組織表面肉眼可見的瘤結節并計數，固定一側肺進行石蠟切片，HE 染色，顯微鏡下觀察計數轉移灶。

3.10Western blot實驗 收集正常對照組和缺氧組對數生長期的MCF-7細胞沉淀，加入RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，按每個孔30 μg的蛋白總量上樣，SDS-PAGE，全濕電轉膜儀進行轉膜。室溫下用TBST溶液(含5%脫脂奶粉)封閉2 h，按說明書分別加入稀釋的Ⅰ抗(HIF-1、GSK-3β、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、MMP-3、MMP-9和β-actin)，4 ℃搖床孵育過夜。次日用TBST洗膜，HRP標記的Ⅱ抗37 ℃振搖1 h后，再洗膜10 min×3次。利用增強的化學發光試劑盒進行ECL檢測目的蛋白。實驗至少重復3次。

4統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。 數據以均數±標準差(mean±SD)表示,用單因素方差分析對兩組間數據差異進行檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1慢性缺氧刺激對人乳腺癌MCF-7細胞活力的影響

利用MTT和CCK-8實驗對常氧或者缺氧條件下培養不同時點的MCF-7細胞的活力進行檢測。MTT結果顯示，在培養24 h后，缺氧組細胞的細胞活力增強，尤其在48 h和60 h，與正常對照組間差異有統計學意義(P<0.05)。CCK-8實驗結果顯示，在培養24 h、36 h和48 h后，缺氧組細胞的細胞活力增強，與正常對照組間差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The effect of chronic hypoxia stress on the viability of human breast cancer MCF-7 cellsinvitro. A: MTT assay; B: CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1慢性缺氧刺激對人乳腺癌MCF-7細胞活力的影響

2慢性缺氧刺激對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

MCF-7活細胞計數結果顯示，在培養24 h、36 h和48 h后，缺氧組細胞的細胞數量明顯增多，與正常對照組的差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effect of chronic hypoxia stress on the proliferration of human breast cancer MCF-7 cellsinvitro. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖2慢性缺氧刺激對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

3慢性缺氧刺激對人乳腺癌MCF-7細胞遷移和侵襲能力的影響

倒置顯微鏡下，對穿過Transwell小室底膜的遷移和侵襲細胞數目進行觀察與計數。結果顯示，與對正常照組相比較，隨著缺氧時間的增加，缺氧組細胞的遷移和侵襲數量增多，遷移和侵襲能力均增強，兩組細胞間差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. Chronic hypoxia stress promoted the migration and invasion abilities of MCF-7 cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖3缺氧慢性刺激促進了人乳腺癌MCF-7細胞的遷移和侵襲能力

4慢性缺氧刺激對人乳腺癌MCF-7細胞非錨定生長及極性的影響

軟瓊脂集落形成實驗以及Matrigel 3D實驗結果顯示，缺氧條件下可使乳腺癌MCF-7細胞的非錨定生長能力提高，且在3D培養系統更容易發生極性改變，呈現侵襲樣生長，見圖4。

Figure 4. The effect of chronic hypoxia stress on anchorage-independent growth and polarity of human breast cancer MCF-7 cellsinvitro.

圖4缺氧慢性刺激對人乳腺癌MCF-7細胞非錨定生長及極性的影響

5慢性缺氧刺激對人乳腺癌MCF-7細胞體內生長及轉移的影響

裸鼠種植瘤實驗結果顯示，人乳腺癌MCF-7細胞接種后裸鼠成瘤率為100%。缺氧對裸鼠腫瘤生長有明顯的促進作用，缺氧組小鼠腫瘤體積明顯大于同一時點正常對照組小鼠腫瘤體積(P<0.05或P<0.01)；分別在正常對照組和缺氧組隨機選取10只小鼠，對發生肺轉移的小鼠進行計數，結果顯示缺氧組小鼠發生肺轉移數目明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果表明，缺氧不僅可以促進乳腺癌細胞在裸鼠體內的生長，同時還促進了乳腺癌細胞在裸鼠體內的轉移，見圖5。

6慢性缺氧刺激對人乳腺癌MCF-7細胞形態及EMT相關蛋白的表達的影響

倒置相差顯微鏡下觀察可見，常氧環境下人乳腺癌MCF-7細胞呈上皮形態，多角形，細胞之間連接緊密，而缺氧組細胞形態拉長，呈梭形，細胞間隙變大，轉變為間質細胞形態。另外，缺氧狀態下，人乳腺癌MCF-7細胞HIF-1達升高，GSK-3β呈現活化趨勢，且上皮樣標志物E-cadherin蛋白表達水平明顯下降，而間充質樣標志物N-cadherin、vimentin、MMP-3和MMP-9蛋白表達水平明顯增加,提示EMT的發生,見圖6。

Figure 5. The effect of chronic hypoxia stress on progression and metastasis of human breast cancer MCF-7 cells in nude mice. A: the subcutaneous tumor growth curves between control group and hypoxia group (Mean±SD.n=3); B: the representative images of subcutaneously implanted tumors taken on day 24; C: the numbers of mice with lung metastasis (n=10).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5缺氧慢性刺激對人乳腺癌MCF-7細胞在裸鼠體內生長及轉移的影響

討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在世界范圍內居第1位，死亡率居第5位[5]，嚴重威脅女性健康。近年來，雖然乳腺癌綜合治療手段的不斷發展，但流行病學調查顯示，乳腺癌的發病率及病死率仍呈逐年上升的趨勢，腫瘤侵襲轉移問題仍是影響乳腺癌治療效果的重要因素[6]。因此，對乳腺癌侵襲轉移機制的研究具有重要的臨床意義。缺氧是實質性腫瘤局部微環境的基本特征之一。近幾年，隨著對缺氧在腫瘤影響方面不斷深入的研究顯示，缺氧對惡性腫瘤的預后起著重要的作用。它既能促進腫瘤細胞的增殖，同時還能夠誘導腫瘤細胞的浸潤和轉移[7-8]。因此，了解慢性缺氧對乳腺癌細胞惡性生物學的影響對乳腺癌的預后有重要意義。

Figure 6. Chronic hypoxia stress promoted EMT in human breast cancer MCF-7 cells. A: the cell morphological changes were observed under reverted microscope; B: the effect of chronic hypoxia stress on the protein expression of EMT-related molecules in the human breast cancer MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6缺氧慢性刺激可促進人乳腺癌MCF-7細胞發生EMT

本研究通過觀察慢性缺氧刺激對體外培養的人乳腺癌細胞MCF-7 的生長、侵襲和遷移能力及細胞非錨定生長能力、極性，以及體內裸鼠成瘤和肺轉移的影響，探討慢性缺氧應激是否會對人乳腺癌MCF-7細胞惡性生物學行為產生影響。

本實驗選用物理缺氧法，采用充入含 1% O2、5% CO2、94% N2混合氣體的三氣培養箱來模擬腫瘤缺氧微環境。我們對實驗組的MCF-7細胞進行體外缺氧培養，對其和正常對照組的細胞進行行為學實驗比較。MTT實驗、CCK-8細胞活力實驗、活細胞直接計數法、Transwell遷移和侵襲實驗等實驗結果顯示，缺氧狀態下，乳腺癌MCF-7細胞的體外細胞活力、增殖能力、遷移和侵襲能力增強，且隨著缺氧時間的加長，對細胞活力刺激的作用越明顯；軟瓊脂集落實驗及3D Matrigel結果顯示，細胞非錨定生長能力提高且在3D培養系統更容易發生極性改變，呈現侵襲樣生長，體內生長及轉移能力增強。這些腫瘤細胞行為學的變化提示在慢性缺氧環境下，乳腺癌MCF-7細胞株的惡性生物學行為加強，且發生了EMT。同時，我們建立裸鼠成瘤模型，觀察慢性缺氧刺激對體內腫瘤生長及肺轉移的影響。結果顯示在同一時點，缺氧組小鼠比正常對照組小鼠腫瘤體積明顯增大，且在肺內形成轉移瘤的數目明顯增加。這一結果說明慢性缺氧可促進腫瘤生長及肺部轉移。

目前眾多研究資料表明，EMT在腫瘤的侵襲和轉移中起到非常關鍵的作用[9]，是啟動惡性腫瘤侵襲轉移的重要途徑之一[10-11]，而缺氧可以通過促進腫瘤細胞發生EMT而在腫瘤的遷移和侵襲過程中發揮著重要作用[12]。EMT發生時，其上皮樣細胞標志分子表達下降，而間充質樣細胞標志分子表達上調，于是我們猜想慢性缺氧應激促進乳腺癌細胞的增殖和轉移這一過程中是否有EMT的發生。我們通過Western blot實驗對EMT相關蛋白表達進行檢測。結果顯示和正常對照組相比，缺氧組細胞上皮樣標志物E-cadherin蛋白表達水平明顯下降，而間充質樣標志物N-cadherin、vimentin、MMP-3和MMP-9蛋白表達水平明顯增加，GSK-3β呈現活化趨勢。同時形態學觀察也得到相同的結果，倒置顯微鏡下可見缺氧組腫瘤上皮細胞間連接松散，細胞失去基底面至表面的極性排列，形態呈梭形。HIF-1也是缺氧環境下促進腫瘤細胞發生 EMT 的重要因子[13]。HIF-1主要通過降低細胞間的黏附、增加基質的降解、增加趨化作用幾個方面對腫瘤細胞的侵襲與轉移產生影響。實驗中我們發現，缺氧組比正常對照組細胞的HIF-1蛋白表達明顯增加。

綜上所述，慢性缺氧刺激可使乳腺癌MCF-7細胞體外生長和遷移能力增強，同時在體內促進腫瘤形成及轉移，并且E-cadherin蛋白表達水平明顯下降，而HIF-1、GSK-3β、N-cadherin、vimentin、MMP-3、MMP-9蛋白表達水平明顯增加。這提示慢性缺氧應激可能通過激活HIF-1使細胞發生EMT進而促進乳腺癌MCF-7細胞惡性進展。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

ChronichypoxiaenhancesaggressivenessofMCF-7breastcancercellsthroughEMT

CHEN Jian1, 2, HE Yong-jing3, WANG Si-ying3, HU Min1

(1AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230028,China;2DepartmentofUltrasonography,TheFirstAffiliatedHospital,XiamenUniversity,Xiamen361001,China;3AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China.E-mail: 598370287@qq.com)

AIM: To investigate the effects of chronic hypoxia on the aggressiveness of MCF-7, a human breast cancer cell line, and the underlying mechanisms.METHODSMCF-7 cells were cultured under hypoxia (1% O2, 5% CO2and 94% N2) or control (95% O2and 5% CO2) condition. The viability, proliferation, and invasion and migration abilities of the MCF-7 cells were determined by MTT assay, CCK-8 assay, cell counting, and cell invasion and migration assays. Anchorage-independent growth and the alteration of cellular polarization of the MCF-7 cells were tested by soft agar colony formation assay and Matrigel-3D culture assay, respectively. The effects of chronic hypoxia on the growth and metastasis of MCF-7 cellsinvivowere investigated by xenograft in nude mice. The morphological changes of the MCF-7 cells were observed under an inverted microscope. Hypoxia-induced alterations in the levels of hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) and phosphorylated glycogen synthase kinase-3β (p-GSK-3β) as well as epithelial-mesenchymal transition (EMT) molecules, such as E-cadherin, N-cadherin, vimentin, matrix metalloproteinase (MMP)-3 and MMP-9, were determined by Western blot.RESULTSChronic hypoxia significantly increased the viability, proliferation, and invasion and migration abilities of MCF-7 cellsinvitro, enhanced the anchorage-independent growth, facilitated cellular polarization alteration in Matrigel-3D culture, and promoted cancer metastasisinvivo. Hypoxia up-regulated HIF-1, activated GSK-3β, down-regulated E-cadherin and increased the protein levels of N-cadherin, vimentin, MMP-3 and MMP-9.CONCLUSIONChronic hypoxia enhances the aggressiveness of breast cancer cells probably through EMT.

Breast carcinoma; Hypoxia; Tumor metastasis; Tumor microenvironment; Epithelial-mesenchymal transition

R363.1; R737.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.016

1000- 4718(2017)10- 1831- 06

2017- 03- 08

2017- 06- 15

中國博士后科學基金第59批面上資助項目(No.2016M592037)；安徽省自然科學基金資助項目(No.1608085MH187)

△通訊作者 Tel: 13955139826； E-mail: 598370287@qq.com

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