溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠的制備與質量評價*

徐偉娜，楊清華△，王勤，王傳棟，劉林，顏紅

(1.山東省藥學科學院，山東省醫用高分子材料重點實驗室，山東 濟南 2501012.山東福瑞達醫藥集團公司，山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，山東 濟南 250101)

1 引 言

生殖道感染及性傳播疾病(STD)流行，是人們生殖健康的主要危害因素。女性生殖道感染，不僅影響到女性的身體健康，影響性生活和心理健康，還可能造成新生兒先天性感染，出生缺陷甚至死亡，從而影響出生人口質量。對女性的生殖道感染，國內外作了大量的研究，使用抗生素治療效果明顯，但抗生素的應用，易造成陰道微環境的菌群失衡，亦引起其他類型的陰道疾病。

健康女性陰道呈適度弱酸性，pH值范圍3.8～4.4。在這個陰道內適宜的酸性條件下，大多數STD病原體沒有活性，包括艾滋病毒、杜氏嗜血桿菌、單純皰疹病毒、沙眼衣原體、淋球菌、梅毒螺旋體，還包括精子。因此，女性陰道的酸性環境期望可使精子和酸敏感STD病原體失活。

原位凝膠(in-situ gel)是指高分子材料以溶液或半固體狀態給藥后，在用藥部位對外界刺激(如溫度、離子、pH等)做出響應，發生分散狀態或者構象的可逆轉換，并在用藥部位轉化為半固體的制劑。與傳統的凝膠制劑相比，原位凝膠制劑有顯著的優點，它可以根據需要調整藥物的滯留與釋放，其生物粘附性可以促進藥物的吸收，制備簡單，使用方便，可以從多種途徑給藥，尤其適用于腔道給藥，如陰道，肛門，眼等[1-5]。

我們通過篩選溫敏智能型高分子材料和酸緩沖體系，制備了溫度敏感型酸緩沖陰道凝膠，具有溫度敏感特性，室溫下為液體，體溫時變為半固體凝膠。這種液體—凝膠轉變的響應速率迅速，使其易于鋪展、附著在陰道壁和子宮頸上，與陰道壁及子宮頸充分接觸，同時便于在陰道內滯留。酸緩沖體系的建立可保持陰道的pH值在3.5～4.5之間，由此恢復和維持正常的陰道酸性環境，消滅引起陰道感染的生物體或抑制其繁殖，維持自然的pH平衡和預防癥狀的復發。

2 儀器與材料

BSA224S-CW 分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；PHSJ-3F 型 pH 計(上海精科)；DK-2000-L 電熱恒溫水浴鍋(天津市素斯特儀器有限公司)；NDJ-8S數字顯示粘度計(上海精密科學儀器有限公司)；LEICA DM/LS顯微鏡(德國LEICA公司)；LEICA RM2135切片機(德國LEICA公司)；倒置相差顯微鏡(Olympus，IX51， Japan)；泊洛沙姆 407(Pluronic-F127，德國 BASF，批號：50011254)；泊洛沙姆 188 ( Pluronic-F68，德國 BASF，批號：50011388)，水為純化水。

3 方法與結果

3.1 凝膠的制備

泊洛沙姆407 150 g，泊洛沙姆188 150 g，羥苯乙酯為1 g，丙二醇為50 g，乳酸7.5 g，乳酸鈉8.0 g，加水至1000 ml，即為1000 ml用量。

將羥苯乙酯加入到丙二醇中，加熱攪拌使溶解，備用。取處方量的乳酸、乳酸鈉加到水中，攪拌使溶解；取處方量的泊洛沙姆407和泊洛沙姆188加到上述水溶液中，攪拌，混合液置4℃冰箱中過夜，直至得到澄清溶液。再將羥苯乙酯的丙二醇溶液加入到含有泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的溶液中，攪拌均勻，即可。

3.2 膠凝溫度的研究[6-7]

取本品5 ml，置玻璃試管中，將一溫度計插入其中。將試管置25℃水浴鍋中，緩慢升溫，升溫速率約為0.5～1℃/min。觀察樣品狀態的變化，將試管傾斜90℃，樣品不流動時的溫度即為膠凝溫度。連續測量三次求平均值，測定的膠凝溫度約為33℃。

3.3 膠凝時間的研究

取本品5 ml，置玻璃試管中。將試管置37℃恒溫水浴中，觀察樣品狀態的變化；記錄樣品達到膠凝溫度所需的時間。連續測量三次求平均值，測定膠凝時間約為90 s。

3.4 黏度的測定

凝膠的黏度是反應其流變學性能的重要參數，照旋轉黏度計測定法(中國藥典2010年版二部)采用NDJ-8型旋轉黏度計，4號轉子，轉速1.5r/min，測量溫度為37℃，測量三次，取其平均值，測定結果約為125.2 Pa·S。

3.5 pH值測定

取本品10 ml，置25 ml小燒杯中，測其pH值，測量三次取其平均值，測定結果約為4.12。

3.6 陰道刺激試驗[8-9]

取健康家兔8只，雌性，隨機分為2組，每組4只，分別作為陰性對照組(0.9%氯化鈉注射液)和試驗組(溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠)。各組家兔給藥前后禁食、禁水3 h。每天定時用特制的消毒注射器將原位凝膠緩慢推入陰道深處。試驗組和對照組給藥劑量均為3 g。每天給藥1次，連續7天。給藥后，觀察家兔身體狀況，包括陰道部位(如充血、水腫及陰道分泌物情況)、臨床表現。末次給藥后24 h內將動物處死，取出陰道及子宮，縱行切開陰道，觀察家兔陰道多次接觸溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應，對陰道組織進行病理學檢查。病理照片見圖1、圖2。

用藥期間，各組家兔未見死亡，體重及攝食正常。各組家兔健康狀況良好，肉眼觀察試驗組家兔的陰道組織，表面光滑，粘膜未見充血、水腫及分泌物。組織病理學檢查陰道組織結構正常，上皮未見明顯增厚，上皮細胞無變性、壞死，無脫落，上皮下無充血、水腫，無炎細胞浸潤。與陰性對照組比較無明顯刺激性改變。

圖1給藥組陰道刺激試驗病理照片

Fig1Pathologicalpicturevaginalstimulationtestfortreatedanimals

圖2對照組陰道刺激試驗病理照片

Fig2Pathologicalpicturevaginalstimulationtestforcontrolgroup

3.7 皮膚過敏試驗(BT法)[10-11]

取豚鼠40只，隨機分為陰性對照組(10只)、陽性對照組(10只)、供試品組(20只)，雌雄各半。各組豚鼠在實驗前24 h將背部脊柱左側脫毛，脫毛區為3 cm×3 cm，脫毛后用溫水洗凈脫毛區。供試品組采用溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠0.2 ml/只進行致敏和激發；陽性對照組采用1%2，4-二硝基氯苯0.2 ml/只進行致敏，0.25%2，4-二硝基氯苯0.2 ml/只進行激發；陰性對照組采用0.9%氯化鈉注射液進行致敏和激發。各組分別于第0、7和14天致敏，第28天激發，激發后24和48 h觀察皮膚紅斑、水腫和其他異常反應等。

供試品和陰性對照組豚鼠受試區皮膚激發接觸6 h，去除受試物后24和48 h觀察均未出現紅斑或水腫，致敏率均為0。陽性對照組豚鼠受試區皮膚于激發接觸6 h，去除受試物24和48 h觀察有輕度或中度紅斑出現，未出現水腫，致敏率為100%。

3.8 體外抑菌試驗

3.8.1試驗菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、綠膿桿菌(ATCC16442)、白色念珠菌(ATCC10231)，均由軍事醫學科學院流行病微生物研究所提供。

參照衛生部2002年版消毒技術規范第2.1.8項。

取直徑5 mm定性濾紙載體蘸取溫敏型陰道原位凝膠平貼于染菌的平板內，置37℃溫箱培養18 h觀察結果。用游標卡尺測量抑菌環的直徑。在21℃條件下，試驗重復三次。

3.8.2結果 溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠對金黃色葡萄球菌平均抑菌環為8.26 mm(8.16～8.42 mm)，對大腸桿菌平均抑菌環為8.19 mm(8.02～8.34 mm)，對綠膿桿菌平均抑菌環為8.07 mm(7.96～8.12 mm)，對白色念珠菌平均抑菌環為0 mm(0～0 mm)。

3.9 體外殺精子試驗

3.9.1精液采集及分析 20例身體健康的成年男性 (平均年齡± SD，35.9±2.3歲)且近期生育過子女的入選本實驗。本實驗經過山東省計劃生育科學技術研究所醫學倫理委員會批準，入選實驗者簽署知情同意書，告知精液僅用于體外殺精子實驗研究。精液標本禁欲3～5天手法取得，置于無菌小燒杯內。30 min內液化。

精液常規分析根據WHO標準。

3.9.2精液質量標準 20例供精子人員符合實驗要求，量>2～<6 ml，pH值 7.0～8.0，液化時間<30 min，精子活動率>70%，活動力a+b級>50%，精子密度>60×106/mL，畸形精子率<60%。

3.9.3試驗方法 參照世界衛生組織WHO推薦修訂的Sander和Cramer方法。取精液0.05 ml置于載玻片上，取溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠與精液混合，倒置相差顯微鏡(室溫或者37℃恒溫，Olympus，IX51， Japan)下觀察結果。當溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠與精液混合后計時開始。倒置顯微鏡(室溫或者37℃恒溫)下觀察精子活動情況，連續觀察20個高倍視野，以精子全部失去活動能力為終點。從精子接觸凝膠時起至全部失活的時間為殺精子時間。每次實驗反復進行2～3次。

體外殺精子效果判定，按WHO推薦的Sander-Cramer方法和標準：

(1)20 s內使精子失活作為具有瞬間快速體外殺精子效果；

(2)20 s～3 min內使精子失活作為具有較強體外殺精子效果；

(3)3 min～5 min內使精子失活作為具有弱體外殺精子效果。

3.9.4結果 溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠在室溫下的體外殺精子時間平均為138.3±30.4 s，在37℃條件下的體外殺精子時間平均為256.1±31.2 s。溫敏型陰道酸緩沖原位凝膠體在室溫下有強體外殺精子作用，37℃條件下具有弱殺精子作用。

4 討論與結論

4.1本品適宜的pH值范圍3.5～4.5。我們選擇適用于陰道環境的醋酸-醋酸鈉緩沖體系和乳酸-乳酸鈉緩沖體系(pH值約為3.6)進行了研究，測定兩種緩沖體系的緩沖能力(以緩沖體系的pH值改變一個單位時所加入的強酸、強堿的量來表示)。結果顯示，醋酸-醋酸鈉緩沖體系中加入強酸和強堿量分別為0.015 mol和0.066 mol，乳酸-乳酸鈉緩沖體系中加入強酸和強堿量分別為0.056mol和0.068mol。說明醋酸-醋酸鈉緩沖體系和乳酸-乳酸鈉緩沖體系對強堿的緩沖能力基本相當，但對強酸的緩沖能力乳酸-乳酸鈉緩沖體系有明顯的優勢。另外，醋酸的pKa=4.75，乳酸的pKa=3.86。可見，乳酸的pKa=3.86更接近于本品適宜的pH值范圍。因此，我們選擇乳酸-乳酸鈉緩沖體系作為本品的緩沖體系。

4.2本品為既具有酸緩沖作用又有溫度敏感特性的陰道用凝膠劑，類似上市產品很少。本品具有適宜的膠凝溫度，室溫條件即成液體狀態，易給藥。給藥后，在較短時間，發揮其溫敏特性成為半固體凝膠狀態，凝膠不易溢出體外，體內滯留時間長，作用持久。本品體感好，易被患者接受。

4.3本品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌有抑菌作用，對白色念珠菌無抑菌作用；對陰道粘膜無刺激、對皮膚無致敏作用。同時，本品還具有一定的殺精子作用，在室溫下殺精子作用較強，在37℃條件下殺精子作用較弱。因此，作為一種能夠提供陰道正常環境的酸性保護產品，本品將具有很好的市場應用前景。