靶基因iNOS、EPO表達對卵巢上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響機制研究

蘇雪鋒+陳桂麗+鄒云峰

[摘要] 目的 研究靶基因誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、促紅細胞生成素（EPO）在卵巢上皮性腫瘤中的表達對卵巢上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響機制。 方法 隨機選取2014年3月～2016年12月我院手術切除并經病理證實的卵巢上皮性腫瘤組織和正常卵巢組織標本共84例。患者均由手術切除取標本切片，經甲醛固定，石蠟包埋，作4 μm連續(xù)切片，分別進行HE染色及免疫組化染色。綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數的百分比進行半定量處理，計數腫瘤細胞總數和陽性細胞個數，計算陽性百分率。 結果 正常卵巢組織上皮細胞中iNOS和EPO幾乎沒有表達，從良性卵巢腫瘤-卵巢交界性腫瘤-惡性卵巢腫瘤，iNOS表達陽性率分別為17.39%、47.06%、87.50%，EPO表達陽性率分別為73.91%、88.24%、100.00%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。腫瘤的組織學分級與EPO及iNOS的表達有關，腫瘤分化程度越低，EPO及iNOS的表達含量越高，且EPO與患者的臨床分期有關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而iNOS與患者的臨床分期無關（P>0.05）。分析發(fā)現，惡性卵巢上皮性腫瘤中EPO蛋白表達和iNOS蛋白表達之間呈正相關，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 EPO蛋白和iNOS蛋白在卵巢上皮性腫瘤能促進腫瘤細胞的增殖及血管生成，對卵巢上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的預測作用。

[關鍵詞] 靶基因iNOS；EPO；卵巢上皮性腫瘤；影響機制

[中圖分類號] R737.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）25-0022-04

Study on the influencing mechanism of target genes iNOS and EPO expression on the occurrence and development of ovarian epithelial tumors

SU Xuefeng1 CHEN Guili1 ZOU Yunfeng2

1.Department of Gynecology and Obstetrics， Yuyao People's Hospital in Zhejiang Province， Yuyao 315400， China； 2.Department of Pathology， Yuyao People's Hospital in Zhejiang Province， Yuyao 315400， China

[Abstract] Objective To study the influencing mechanism of expression of target gene-inducing nitric oxide synthase （iNOS） and erythropoietin（EPO） in ovarian epithelial tumors on the occurrence and development of ovarian epithelial tumors. Methods A total of 84 cases of specimens of ovarian epithelial tumor tissue and normal ovarian tissue who were given incision and pathologically confirmed in our hospital from March 2014 to December 2016 were randomly selected. Patients were all given surgical incision to remove the slices of specimens， fixed by formaldehyde， embedded by paraffin to make a 4 μm continuous slices. Immunohistochemical staining and HE staining were performed respectively. Comprehensive staining intensity and percentage of positive cells in the total number of cells were used to perform semi-quantitative treatment. The total number of tumor cells and the number of positive cells were counted， and the positive percentage was calculated. Results iNOS and EPO in normal oviran epithelial cells were barely expressed. The positive rates of iNOS expression were 17.39%， 47.06% and 87.50% respectively in benign ovarian tumors-ovarian borderline tumors-malignant ovarian tumors. The positive rates of EPO expression were 73.91%， 88.24% and 100.00% respectively. The differences were statistically significant（P<0.05）. The histological grade of tumor was related to the expression of EPO and iNOS.The lower the degree of tumor differentiation， the higher the expression level of EPO and iNOS. EPO was correlated with the clinical stage of the patients， and the difference was statistically significant（P<0.05）； and iNOS was not correlated with clinical stage（P>0.05）. There was a positive correlation between EPO protein expression and iNOS protein expression in malignant epithelial ovarian tumors， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion EPO protein and iNOS protein can promote tumor cell proliferation and angiogenesis in epithelial ovarian tumors， and have a certain predictive effect on the occurrence and development of ovarian epithelial tumors.endprint

[Key words] Target gene iNOS； EPO； Ovarian epithelial tumors； Influencing mechanism

卵巢上皮性腫瘤發(fā)病位置隱匿，易于擴散和轉移，生存率低，是造成女性患者死亡的重要原因[1]。如何提高惡性卵巢上皮性腫瘤的早期診斷率及預后評價的準確性，是臨床亟待解決的難題[2]。近年來，多種腫瘤因子被用于預測腫瘤的病變程度，但未找到特異性高、敏感性強的指標指導臨床治療方案。誘導型-氧化氮合酶（iNOS）只在病理狀態(tài)下通過催化生成血管舒張因子實現病理中的生物學過程[3]。促紅細胞生成素（EPO）是一種糖蛋白激素，由腎和肝臟產生，具有增加血紅細胞、調節(jié)荷爾蒙的作用[4-5]。基于以上研究基礎，iNOS和EPO蛋白的聯合檢測研究惡性卵巢上皮性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，尋找臨床診斷依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇2014年3月～2016年12月間我院手術切除并經病理證實的84例卵巢上皮性腫瘤組織和正常卵巢組織患者，其中正常卵巢組織12例，年齡37～72歲，平均（47.24±6.08）歲；良性卵巢上皮性腫瘤23例，年齡35～72歲，平均（45.21±9.52）歲；卵巢交界性上皮性腫瘤17例，年齡32～73歲，平均（43.27±8.52）歲；其中惡性卵巢上皮性腫瘤32例，年齡36～73歲，平均（46.48±9.42）歲。各組間年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在32例惡性卵巢癌中：黏液性囊腺癌11例，漿液性囊腺癌16例，其他類型5例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期21例；組織學分級：高分化14例，中低分化18例。排除標準：排除術前接受放療、化療及免疫治療的患者。該研究獲得了醫(yī)院倫理學批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

患者均由手術切除取標本切片，經甲醛固定后石蠟包埋，作4 μm連續(xù)切片，分別進行HE染色及免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟至水，H2O2滅活內源性過氧化物酶，微波修復抗原，正常山羊血封閉，EpoR單克隆抗體以1：20稀釋，4℃過夜，滴加過氧化物及生物素化二抗標記抗體，DAB顯色，蘇木精復染脫水封片。將染色陽性的卵巢癌組織作為陽性對照，選擇PBS代替一抗為陰性對照。EPO、iNOS蛋白陽性標準為腫瘤細胞胞漿出現棕黃色顆粒，參照Bimer方法，利用半定量方法處理綜合染色強度和陽性細胞占總細胞數的百分比。在400倍光鏡下隨機選擇5個高倍視野觀察區(qū)域，統(tǒng)計陽性細胞數和腫瘤細胞總數，算出陽性率。

1.3 觀察指標

染色強度評分[6]：染色強為3分，染色清晰為2分，染色弱但強于陰性顏色為1分；10%≤陽性率≤50%為2分，51%≤陽性率≤80%為3分，>80%為4分。兩項評分加和，不管其染色強度，只要陽性率<10%為（-）；3分為（+）；4～5分為（++）；6～7分為（+++）。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，計數資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計量資料以例表示，兩組間比較采用χ2檢驗；等級資料用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同卵巢組織中iNOS和EPO的表達比較

正常卵巢組織上皮細胞中iNOS和EPO幾乎沒有表達，從良性卵巢腫瘤-卵巢交界性腫瘤-惡性卵巢腫瘤，iNOS表達陽性率分別為17.39%、47.06%、87.50%，EPO表達陽性率分別為73.91%、88.24%、100.00%，數據比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 惡性卵巢癌組織學分級及臨床分期與iNOS及EPO關系比較

腫瘤的組織學分級與EPO及iNOS的表達有關，腫瘤分化程度越低，EPO及iNOS的表達含量越高，且EPO與患者的臨床分期有關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而iNOS與患者的臨床分期無關（P>0.05）。見表2。

2.3 惡性卵巢上皮性腫瘤與EPO、iNOS蛋白表達的相關性

分析發(fā)現，惡性卵巢上皮性腫瘤中EPO蛋白表達和iNOS蛋白表達之間呈正相關，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

在婦女生殖道癌瘤中，卵巢是造成患者死亡和生存者功能障礙的主要原因[7]。引起患者月經紊亂，性功能和生育功能障礙，嚴重影響患者生存期的生活質量[8]。臨床研究證明，卵巢上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多因素及基因的復雜過程[9-10]。腫瘤細胞高度增殖導致組織缺氧，通過自身作用適應和調節(jié)缺氧環(huán)境，腫瘤細胞仍不斷浸潤、增殖[11-15]。有學者認為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展必然導致患者缺血缺氧，從而誘導靶基因一氧化氮合酶（iNOS）和促紅細胞生成素（EPO）的合成和分泌。機體通過增加靶基因在腫瘤組織中的表達量，使腫瘤細胞適應缺血缺氧環(huán)境，加速腫瘤細胞的侵襲和轉移[16-17]。

iNOS在正常生理狀態(tài)不表達，只有在病理條件下通過催化一氧化氮因子來實現病理的生物學過程轉化[18]。NO的腫瘤病理生物學具有雙重調節(jié)作用，高濃度時抑制腫瘤生長；低濃度時促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究證明，NO既能維持和完善血管內皮生長因子（VEGF）的生物學功能；又能激活環(huán)氧合酶而刺激產生前列腺素，這兩種物質均可促進形成腫瘤新生血管[19]。腫瘤細胞的iNOS蛋白表達量高于正常組織，且與腫瘤分級、分期呈正相關關系。促紅細胞生成素（EPO）的特異性膜受體屬于Ⅰ型細胞因子受體，由胞外配體跨膜域、結合域及包內域三部分組成[20]。EPO在腫瘤細胞及血管內皮細胞中均有表達，具有抑制腫瘤細胞及血管內皮細胞的凋亡，促進增殖分化。EPO通過減少神經細胞的壞死和保護凋亡發(fā)揮神經，抑制iNOS蛋白表達保護EPO而發(fā)揮保護作用。實驗表明，EPO具有保護內源性抗氧化酶SOD活性，能保護卵巢上皮細胞免受過氧化酶的傷害，維持細胞膜的穩(wěn)定性[21]。endprint

研究顯示，正常卵巢組織上皮細胞中iNOS和EPO幾乎沒有表達，從良性卵巢腫瘤-卵巢交界性腫瘤-惡性卵巢腫瘤，iNOS表達陽性率分別為17.39%、47.06%、87.50%，EPO表達陽性率分別為73.91%、88.23%、100.00%，這說明iNOS和EPO的陽性表達率促進了腫瘤細胞的生長作用，隨著iNOS貯存誘導產生大量的NO促發(fā)細胞毒作用。大量的NO與上皮腫瘤細胞產生的氧自由基結合生成氧亞硝酸鹽陰離子（ONOO-），進一步分解產生自由基HO.；HO.與ONOO-都具有強氧化性，使細胞膜發(fā)生脂化損壞卵巢上皮細胞[22-23]。腫瘤的組織學分級與EPO及iNOS的表達有關，腫瘤分化程度越低，EPO及iNOS的表達含量越高，且EPO與患者的臨床分期有關；而iNOS與患者的臨床分期無關。分析發(fā)現，惡性卵巢上皮性腫瘤中EPO蛋白表達和iNOS蛋白表達之間呈正相關。

綜上所述，EPO蛋白和iNOS蛋白在卵巢上皮性腫瘤能促進腫瘤細胞的增殖及血管生成，對卵巢上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的預測作用。

[參考文獻]

[1] 陳靜，李春艷，趙苗青，等.EZH2蛋白在卵巢上皮性腫瘤中的表達及其作用[J].山東大學學報醫(yī)學版，2015， 60（2）：65-70.

[2] 武紅，高蜀君，程劫.卵巢上皮性腫瘤患者人乳頭狀瘤病毒感染及核轉錄因子表達與臨床相關性研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2015，25（1）：8-10.

[3] Chiu WT，Huang YF，Tsai HY，et al.FOXM1 confers to epithelial-mesenchymal transition， stemness and chemoresistance in epithelialovarian carcinoma cells[J].Oncotarget，2015，6（4）：2349-2365.

[4] 喬海芝，李淼，錢智.Galectin-3、CAⅨ在卵巢上皮性腫瘤的表達及意義[J].中國婦產科臨床雜志，2015，16（1）：63-64.

[5] Chevalier N，Paris F，Fontana S，et al.Postpubertal persistent hyperestrogenemia in mccune-albright syndrome：Unilateral oophorectomy improved fertility but detected an unexpected borderline epithelial ovarian tumor[J]. J Pediatr Adolesc Gynecol，2015，28（6）：169-172.

[6] 邱建，傅云峰，周彩云，等.上皮性卵巢癌組織CK2β和p53蛋白表達臨床意義分析[J]. 中華腫瘤防治雜志，2015， 22（6）：451-456.

[7] Ma J，Zhou C，Yang J，et al.Expression of AQP6 and AQP8 in epithelial ovarian tumor[J]. J Mol Histol，2016， 47（2）：129-134.

[8] 王偉明，劉輝，秦金金，等. DJ-1蛋白在卵巢上皮性腫瘤組織和血清中的表達及相關性[J].中國現代醫(yī)學雜志，2015，25（14）：30-34.

[9] 晉一超，孫瑩，周洋，等.血脂水平與卵巢上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關性分析[J].南京醫(yī)科大學學報（自然科學版），2015，35（7）：1013-1016.

[10] Benedetto G，Hamp TJ，Wesselman PJ，et al.Identification of epithelial ovarian tumor-specific aptamers[J].Nucleic Acid Ther，2015，25（3）：162-172.

[11] 陳曉端.卵巢上皮性腫瘤常見病理診斷問題及臨床意義[J].實用婦產科雜志，2015，31（11）：808-810.

[12] 李紅雨，韓會會，朱海，等.惡性卵巢上皮性腫瘤組織中miR-181a、TGF-β_1、TGF-βR1的表達變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2015，55（43）：59-61.

[13] Oswald AJ，Gourley C.Low-grade epithelial ovarian cancer：A number of distinct clinical entities？[J]. Curr Opin Oncol，2015，27（5）：412-419.

[14] 王哲，劉欣.惡性卵巢上皮性腫瘤組織中Gab2蛋白的表達變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2015，55（43）：62-63.

[15] 李娜，孫麗君，李東林，等.檢測ROC1在卵巢惡性上皮性腫瘤組織中的表達及臨床意義研究[J].重慶醫(yī)學，2016，45（2）：202-204.

[16] Ramalingam P. Morphologic，immunophenotypic，and molecular features of epithelial ovarian cancer[J].Oncology（Williston Park）， 2016，30（2）：166-176.

[17] 肖正華，令狐華，劉倩芬.Ras和Sos1蛋白在上皮性卵巢惡性腫瘤組織中的表達及臨床意義[J].南方醫(yī)科大學學報，2016，36（11）：1502-1507.

[18] 葛倩倩，陳秀芹，郭琦，等.CD146和TfR1在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義[J].西安交通大學學報（醫(yī)學版），2017，38（1）：104-107.

[19] Madsen C，Baandrup L，Dehlendorff C，et al.Tubal ligation and salpingectomy and the risk of epithelial ovarian cancer and borderline ovariantumors：A nationwide case-control study[J]. Acta Obstet Gynecol Scand，2015，94（1）：86-94.

[20] 唐燦，鄒瓊，粟占三，等.卵巢漿液性腫瘤中IGF-2R的表達及其意義[J].臨床與實驗病理學雜志，2016，32（9）：1041-1043.

[21] 胡娜，魯艷明.上皮性卵巢組織G3BP和OPN表達及相關性研究[J].中華腫瘤防治雜志，2016，23（21）：1421-1425.

[22] Qu H，Xu F，Bai Y，et al.Tumor suppressor in lung cancer 1 gene expression in epithelial ovarian cancer[J].Indian J Cancer，2016，53（1）：8-11.

[23] 葛靜，王景，滑芳，等.細胞周期蛋白E1與卵巢上皮性腫瘤關系的研究[J].中國急救醫(yī)學，2015，35（s2）：171-172.endprint