人類尿液來源干細胞的體外培養和生物學特性分析

牛鑫，張國威，汪泱

(上海交通大學附屬第六人民醫院，1、四肢顯微外科研究所；2、神經外科，上海200233)

·論 著·

人類尿液來源干細胞的體外培養和生物學特性分析

牛鑫1，張國威2，汪泱1

(上海交通大學附屬第六人民醫院，1、四肢顯微外科研究所；2、神經外科，上海200233)

目的 從人類尿液中直接分離能夠體外大量擴增且具有多向分化潛能的干細胞，并研究其生物學特性。方法 收集志愿者尿液100～200ml，經離心后使用完全培養基重懸，接種于培養板中；克隆貼壁生長后換液。大量擴增后通過流式細胞術檢測其表面標志物，使用成骨、成軟骨誘導培養基對其進行誘導分化，通過茜素紅染色、阿利新藍染色檢測誘導分化結果。結果 每100m l尿液經14d培養能夠直接分離得到3～10個克隆，傳代培養至第5代時可擴增至2～10×107個尿液來源干細胞，能夠滿足細胞治療需要。尿液來源干細胞表面標志物CD29，CD44，CD73，CD90為陽性，CD34，CD45，HLA-DR為陰性，與間充質干細胞一致。經誘導培養后，尿液干細胞能夠能夠成骨、成軟骨分化。結論 尿液來源干細胞具有間充質干細胞特性，可以作為細胞治療、組織工程中的種子細胞。

尿液來源干細胞；間充質干細胞；種子細胞

細胞治療是攻克危重疾病、修復難愈合損傷的新型療法。干細胞因其增殖能力旺盛，具有多向分化潛能、能夠分泌多種因子等生物學特性通常被選為細胞治療的種子細胞。種子細胞的來源和培養是長期以來限制細胞治療發展的關鍵因素。目前，可用于細胞移植療法的種子細胞主要為胚胎干細胞、誘導多能性干細胞和骨髓、脂肪等多種組織來源的間充質干細胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）。胚胎干細胞來源有限，培養方法復雜，面臨倫理、成瘤問題以及異體移植的免疫排斥風險[1]；誘導多能性干細胞誘導、培養過程復雜，且有成瘤風險；骨髓、脂肪來源的間充質干細胞因其可以自體取材、成瘤風險低、且免疫排斥風險低，在細胞治療中具有一定優勢，并被廣泛研究。例如，經研究證實，骨髓來源間充質干細胞能夠在體外直接分化為神經元[2]；在體內實驗中，骨髓來源間充質干細胞能夠遷移至缺血半影區[3]。此外，骨髓來源間充質干細胞還能夠促進血管生成[4，5]，抑制凋亡[6]，分泌營養因子[7]。將骨髓來源間充質干細胞自體移植，能夠顯著促進糖尿病足壞死創面的愈合[8]。但是，骨髓、脂肪來源間充質干細胞取材過程有創，給病人造成額外痛苦和負擔。因此，尋找來源無創的移植種子細胞一直是干細胞研究領域持續關注的熱點問題。

尿液能夠作為檢測、診斷多種疾病的生物樣本，蘊含豐富的代謝產物、生物大分子、囊泡、細胞等內容物[9-12]，并且能夠無創、大量獲取。鑒于此，我們嘗試從尿液中獲取干細胞。經過摸索，我們建立了從尿液中直接分離培養干細胞，即尿液來源干細胞（urine-derived stem cell，USCs）的新體系。 我們利用特性成分培養基，通過簡單離心，從人體尿液中分離得到一種干細胞，其可表達CD44、CD73、CD90、CD29等標志物，并具有多向分化潛能。尿液干細胞獲取過程無創，獲取過程簡單，且能夠多次無限量獲取，從而為干細胞的研究和利用增加了一個極其安全、便利的細胞來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 尿液由成年健康志愿者捐贈捐贈過程符合上海市第六人民醫院倫理委員會各項規定。捐贈者留取清潔中段尿液100～200ml，以備使用。

1.1.2 主要儀器生物安全柜 （Thermo），CO2培養箱（Thermo），離心機。

1.1.3 主要試劑100×antibiotic antimycotic（GIBCO，15240062），尿液干細胞完全培養基（DMEM/F12 培養基（Corning），優級胎牛血清（GIBCO）2%，EGF （Perprotech）10ng/ml，PDGF （Millipore）2ng/ml，TGF-beta（Perprotech）1ng/ml，bFGF （Perprotech）2ng/ml，氫化可的松（Sigma）0.5mM，胰島素（GIBCO）25mg/ml，轉鐵蛋白（sigma）20mg/ml，腎上腺素549ng/mL，三碘甲狀腺氨酸 125ng/ml），0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）（GIBCO）， 磷酸緩沖液（PBS）（Corning），明膠（上海國藥集團），多聚甲醛（上海國藥集團），成骨誘導培養基（GIBCO），成軟骨誘導培養基（GIBCO），茜素紅（Sigma），阿利新藍（Sigma）。 直 標 抗 體 ：CD34-APC(BD No.560940)，CD45-FITC(BD No.560976)，CD29-PE(BD No.561795)，CD44-FITC(BD No.560977)，CD73-PE(BD No.561014)，CD90-PE(BD No.560970)，HLA-DRPE(BD No.560943)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離將0.1%明膠按1.5ml/孔加入6孔板，置于CO2培養箱中，在37℃下靜置2h完成包被。細胞接種前棄去明膠。取尿液樣本后，按每100ml尿液加入 5ml 100×antibiotic antimycotic，充分輕柔混勻，400g離心10min；棄上清，使用PBS清洗沉淀物，然后再次400g離心10min。離心后棄去上清，每100ml尿液的沉淀物使用6ml尿液干細胞完全培養基重懸，并以0.2ml/cm2接種于包被過的培養板。接種次日觀察樣本是否污染，接種后7d更換完全培養基，并觀察克隆。克隆生長至細胞緊密接觸時使用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）進行傳代。

1.2.2 USCs表面標志物的鑒定 USCs傳代培養至第4代，將融合度為90%的USCs消化至單個細胞，使用4%多聚甲醛在室溫固定10min，200g離心5min棄去上清，使用PBS清洗，200g再次離心5min后棄去上清，重懸至適宜密度并按說明書推薦濃度加入直標抗體，并按說明書推薦時間、溫度孵育；孵育后200g離心5min，使用PBS清洗游離抗體，200g再次離心5min，將細胞重懸至200μl，經GUAVA easyCyte6HT檢測。

1.2.3 USCs誘導分化USCs傳代培養至第 5～7代，將融合度為100%的USCs棄去培養基，PBS清洗后更換成骨誘導培養基或成軟骨誘導培養基進行誘導分化。誘導培養基隔天換液，誘導28d后分別進行染色。

1.2.4 茜素紅染色將誘導后細胞棄上清，PBS清洗后使用4%多聚甲醛室溫固定10min。洗凈殘留固定劑后加入0.1%茜素紅溶液室溫染色10min。PBS洗去浮色后于光鏡下觀察。

1.2.5 阿利新藍染色將誘導后細胞棄上清，PBS清洗后使用4%多聚甲醛室溫固定10min。洗凈殘留固定劑后加入阿利新藍溶液室溫染色30min。PBS洗去浮色后于光鏡下觀察。

2 結果

2.1 細胞分離培養結果尿液經離心、清洗、重懸，約80%的樣品在接種后第5～7d開始出現克隆，即為USCs。USCs克隆通常為圓形，克隆內細胞主要為梭形（圖1a）。部分克隆內偶有出現上皮樣細胞，傳代后此類細胞消失。接種14d后，每100ml尿液能夠直接分離獲得3～10個克隆。傳代后，USCs細胞形態均一，呈梭形、渦旋狀生長（圖1b），符合間充質干細胞形態特點。傳代培養至第5代時可擴增至2～10×107個USCs，并能夠穩定傳代至8代以上，能夠滿足細胞治療需要。部分USCs貼壁后不呈現明顯克隆狀態（圖1c，d），乃至成球生長，但仍可較快速生長，并被傳代至8代以上。

圖1 人類尿液離心后分離獲得增殖旺盛的克隆（a）；傳代培養后細胞生長旺盛，呈梭形渦旋狀生長（b）；部分USCs貼壁時不呈現明顯克隆狀態，或成球生長（c，d）。標尺200μm。

2.2 細胞表面標志物檢測結果將傳代后USCs進行流式細胞術檢測，發現USCs細胞表面高表達CD29（98.62%）、CD44（99.62%）、CD73（94.44%）、CD90（90.44%）等標志物，不表達 CD34（2.84%）、CD45(2.84%)、HLA-DR(2.12%)等標志物，符合間充質干細胞表面標志物特點（圖2a-g）。因此，我們推斷USCs具有間充質干細胞的特性，并且具有間充質干細胞必備的多向分化潛能。

圖2 流式細胞術檢測USCs表面標志物，其中CD29（a），CD44（c），CD73 （e），CD90 （f） 表達為陽性；CD34 （b），CD45（d），HLA-DR（f）表達為陰性。

2.3 細胞誘導分化結果我們將傳代培養至5～7代的USCs進行成骨、成軟骨誘導分化。USCs經28d成骨誘導之后，細胞間產生大量沉淀物，且沉淀物茜素紅染色結果為陽性，證明沉淀為鈣結節，USCs經誘導后已向成骨方向分化 （圖3a）。USCs經28d成軟骨誘導之后，細胞生長緊密，產生大量細胞間質，且阿利新藍結果為陽性，證明已有大量糖蛋白產生，USCs有成軟骨分化潛能（圖3b）。

圖3 USCs成骨誘導后經茜素紅染色，呈現大量鈣結節陽性（a），成軟骨誘導后經阿利新藍染色，呈現大量糖蛋白陽性（b）。標尺10μm。

3 討論

細胞治療的效果高度依賴于種子細胞的選擇。終末分化細胞因其難以體外培養不宜作為種子細胞。胚胎干細胞難以獲取，培養條件嚴苛，存在倫理問題，并且不可能獲得自體細胞，因而使用后需面臨免疫排斥風險。誘導多能性干細胞在誘導過程中可能使用病毒，并具有較強成瘤性，存在安全風險。因此，在體外能夠大量增殖、并具有多向分化潛能、且成瘤性低的間充質干細胞表現出作為種子細胞的巨大優勢。間充質干細胞通常從骨髓、脂肪等多種中分離獲得[13-16]，能夠自體獲取，并長期作為細胞治療的種子細胞使用。然而，骨髓來源、脂肪來源以及臍帶血來源間充質干細胞取材過程有創，且來源有限，難以實現多次取材，限制其后續應用。在本項研究中，我們通過簡單離心從人尿液中分離得到可以貼壁生長的USCs，其表面標志物與間充質干細胞一致，能夠在體外大量擴增，并具有成骨、成軟骨分化潛能。USCs在生物學特性上與間充質干細胞相當，且取材過程無創、簡便，單次取材提供的細胞（2～10×107個）即可滿足一般細胞治療對種子細胞數量的要求。且USCs的來源決定治療過程中能夠對同一供體進行多次取材，可以滿足長期、多次、多療程治療的需要，是理想的自體種子細胞來源，具有良好應用前景。已有的從尿液中分離細胞的研究[17]主要著眼于將其誘導為誘導多能性干細胞，對尿液來源細胞本身的特性、功能研究較少。我們的研究建立了從尿液中分離可多次傳代、大量擴增的干細胞的技術體系，并細致分析了細胞表面標志物，測試了細胞的多向分化潛能，加深了對尿液來源細胞的認識，為細胞治療提供了種子細胞新來源。

[1]Frankel MS.In search of stem cell policy[J].Science，2000，287：1397.

[2]Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al.Adult rat and human bonemarrow stromal cells differentiate into neurons[J].JNeu?rosci Res，2000，61：364-370.

[3]Yilmaz G，Vital S，Yilmaz CE，et al.Selectin-mediated recruitment of bone marrow stromal cells in the postischemic cerebral microvasculature[J].Stroke，2011，42：806-811.

[4]Chen J，Zhang ZG，Li Y，et al.Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats[J].Circ Res，2003，92：692-699.

[5]呂世剛，祝新根，張愛軍，等.骨髓間充質干細胞移植對腦缺血區微血管增生及Notch1表達的影響[J].實驗與檢驗醫學，2009，27(1)：1-4.

[6]Chen J，Li Y，KatakowskiM，et al.Intravenous bonemarrow stromal cell therapy reduces apoptosis and promotes endogenous cell proliferation after stroke in female rat[J].JNeurosci Res，2003，73：778-786.

[7]Tate CC，Fonck C，McGrogan M，et al.Human mesenchymal stromal cells and their derivative，SB623 cells，rescue neural cells via trophic support following in vitro ischemia[J].Cell Transplant，2010，19：973-984.

[8]夏洪嬌，蘇曉清，張雅薇.人自體骨髓干細胞移植治療糖尿病足的臨床應用[J].實驗與檢驗醫學，2009，27(3)：235-237.

[9]Husain H，Melnikova VO，Kosco K，et al.Monitoring Daily Dynamics of Early Tumor Response to Targeted Therapy by Detecting Circulating Tumor DNA in Urine[J].Clin Cancer Res，2017，23(16)：4716-4723.

[10]Pellegrini KL，Patil D，Douglas KJS，et al.Detection of prostate cancer-specific transcripts in extracellular vesicles isolated from post-DRE urine[J].Prostate，2017，77(9)：990-999.

[11]Franzen CA，Blackwell RH，Foreman KE，et al.Urinary Exosomes：The Potential for Biomarker Utility，Intercellular Signaling and Therapeutics in Urological Malignancy[J].J Urol，2016，195(5)：1331-1339.

[12]Macgregor-Ramiasa M，McNicholas K，Ostrikov K，et al.A platform for selective immuno-capture of cancer cells from urine[J].Biosens Bioelectron，2017，96：373-380.

[13]FriedensteinAJ，Piatetzky SII，Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells[J].J Embryol Exp Morphol，1966，16(3)：381-390.

[14]Friedenstein AJ，Chailakhyan RK，Latsinik NV.Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues.Cloning in vitro and retransplantation in vivo[J].Transplantation，1974，17(4)：331-340.

[15]Friedenstein AJ.Stromal mechanisms of bone marrow：cloning in vitro and retransplantation in vivo[J].Haematol Blood Transfus，1980，25：19-29.

[16]Zuk PA，Zhu M，Ashjian P.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell，2002，13(12)：4279-4295.

[17]Zhou T，Benda C，Dunzinger S，et al.Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples[J].Nat Protoc，2012，7(12)：2080-2089.

In vitro Culture and Biological Characteristics of Urine-Derived Stem Cells

NIU Xin1，ZHANG Guowei2，WANG Yang1.
1.Institute ofMicrosurgery on Extremities，The Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University，Shanghai200233，China;2.Departmentof Neurosurgery，The Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University，Shanghai200233，China.

Objective To directly isolate in vitro proliferative and multipotential stem cells from urine specimen and study their biological characteristics.M ethods 100～200m l urine were collected from volunteers，and further to centrifuged urine and resuspended the precipitate，then seeded the suspension into tissue culture plates.Changed fresh media after clones appeared.Detected cell surface markers through flow cytometry.Osteogenic and chondrogenic induction were performed followed by Alizarin Red S staining and Alcian Blue staining.Results We could isolated 3～10 clones from 100m l urine after cultured for 14 days.After subculturing to the fifth generation we harvest 2～10×107cells.These urine-derived stem cells expressed CD29，CD44，CD73 and CD90，but not expressed CD34，CD45 and HLA-DR，which is consistentwithmesenchymal stem cells.Conclusion Urine-derived stem cells have similar biological characteristics with mesenchymal stem cells，and could act as seed cells for cell therapy and tissue engineer.

Urine-derived stem cells；Mesenchymal stem cells；Seed cells

Q813.1+1，R446.62

A

1674-1129(2017)05-0638-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.002

國家自然科學基金（No.81501863）；上海市第六人民醫院院級課題（No.1634）

牛鑫，女，1984年生，碩士，研究實習員，研究方向為干細胞與再生醫學。

汪泱，女，1963年生，教授，博士生導師，研究方向為干細胞與再生醫學，Email：wangy63cn@126.com

2017-07-25；

2017-08-29)