江西地區強直性脊柱炎患者HLA-B27基因PCR-SBT分型研究

何華慶，肖莉，韓玲，沈冰，唐綺，李國良

(江西省血液中心，江西 南昌 330052)

·實驗研究·

江西地區強直性脊柱炎患者HLA-B27基因PCR-SBT分型研究

何華慶，肖莉，韓玲，沈冰，唐綺，李國良

(江西省血液中心，江西 南昌 330052)

目的 探討江西地區人群HLA-B27亞型分布情況，分析HLA-B27亞型與強直性脊柱炎（AS）的相關性。方法采用PCR-SBT（測序法）高分辨率基因分型技術，對HLA-B27 PCR-SSP（序列特異性引物-聚合酶鏈法）低分辨基因檢測陽性的97例AS確診患者標本和2013年1-12月本實驗室檢測的1001名江西省造血干細胞志愿捐獻者中22名HLA-B27攜帶者進行HLA-B27基因高分辨率分型。結果 97例HLA-B27陽性的AS確診患者標本中，進一步采用PCR-SBT高分辨率分型檢測，其中81例為B27*04亞型，占83.51%，其余16例為B27*05亞型，占16.49%；造血干細胞志愿捐獻者檢出22例HLA-B27攜帶者，HLA-B27亞型分布為：1例B27*02亞型，1例B27*03亞型，15例B27*04亞型，1例B27*06亞型，4例B27*07亞型，未發現B27*05亞型。結論 江西地區的AS患者HLA-B27基因亞型以B27*04為主，其次為B27*05。健康人群B27基因攜帶者與AS患者在主導亞型分布上沒有明顯的差異，但在亞型種類上存在差異。

強直性脊柱炎；HLA-B27；PCR-SBT；HLA-B27*04；HLA-B27*05

1 材料與方法

1.1 對象 2013年9月至2014年8月于江西省血液中心輸血研究室HLA-B27 PCR-SSP低分試劑檢測結果為陽性的97例AS確診患者。對照組：江西省中華骨髓庫志愿捐獻者中HLA-B27健康攜帶者及2013年1-12月本實驗室檢測的1001名江西省造血干細胞志愿捐獻者中22名HLA-B27攜帶者。

1.2 DNA提取 應用RBC Bioscience公司全血基因組DNA提取試劑盒，嚴格按試劑盒說明書獲取DNA，檢測DNA濃度與純度，調整至DNA濃度40～100ng/μl，純度 1.7～2.0。

1.3 PCR-SSP方法采用MorganTMHLA-B27 SSP檢測試劑盒(TBG美國德州生物基因有限公司)，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 電泳檢測取全部擴增產物在含有EB(8mg/m l)的2%瓊脂糖凝膠上電泳，100V電壓電泳15min后，在全自動凝膠成像儀上拍照并觀察結果。

1.5 HLA-B基因分型 PCR-SBT方法對PCR-SSP方法顯示陽性結果采用PCR-SBT高分辨率分型試劑盒(德國諾詩康瀛公司)，嚴格按照試劑盒說明書操作，結果由軟件自動判讀。

1.6 統計學分析基因頻率計算采用基因計數法計算AS患者及正常人群HLA-B27亞型基因頻率[1]。采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性意義。

強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，AS)受多種因素影響，其中遺傳在AS的發病中起十分重要的作用。研究表明，AS患者中HLA-B27陽性率高達96%，而正常人陽性率僅為4%～6%[2]。近年基因分型技術的研究證實B27不是單一抗原，而是由多種等位基因所控制的亞型構成，且存在人種和地區差異[3]。我們應用聚合酶鏈反應-直接測序方法(PCR-SBT)對本地區HLA-B27健康攜帶者和本中心PCR-SSP低分辨基因檢測陽性AS確診患者的HLA-B27進行亞型分型，統計分析兩者亞型的差異。為進一步探討HLA-B27亞型與AS的相關性，以期為本地區AS的防治提供有用的依據。

2 結果

對97例AS患者HLA-B27陽性標本及2013年1-12月本實驗室檢測的1001名江西省造血干細胞志愿捐獻者中22（2.2%）名HLA-B27攜帶者進行PCR-SBT高分辨率分型，得到的基因亞型見表1。

中國不同地區HLA-B27*04、HLA-B27*05的分布頻率從表2的數據分析表明中國漢族各地區間存在一定的差異。

表1 江西地區AS患者及健康對照組HLA-B27基因亞型分布

表2 中國不同地區HLA-B*2704、2705亞型的分布率（%）

3 討論

AS患者遍及世界各地，其總體發病率約為7.3/100000，在我國AS發病率約為0.3%，多見于中青年男性，且AS致殘率高，故早期確診并及時治療對患者非常重要[11]。研究表明HLA-B27存在多個等位基因，具有高度多態性，目前較為肯定的AS 易感基因有 B*2702、B*2704、B*2705、B*2707、B*2708、B*2710、B*2714、B*2715和B*2719等[12，13]。B*2705亞型在白種人與高加索人種是最主要的亞型，占90%左右；B*2703是黑種人尤其是西非人的主要亞型，占61%；亞洲人與B*2705、B*2704、B*2706、B*2707 相關，在中國漢族人群中HLA-B*2705和HLA-B*2704亞型為主要亞型，分別占40.68%和50.85%。B*2706在東南亞人群中廣泛分布，AS發病率在馬來西亞人中很低，這可能就與B*2706的保護作用相關；B*2707則主要存在于泰國、印度和中國人中。HLA-B27亞型的分布頻率在不同民族間存在差異可能主要受HLA-B27易感性因素或地理環境因素差異的影響[14]。此外有報道提到B*2703和B*2707與AS呈負相關，B*2706和B*2709被認為是一種保護性基因[15-17]。

本文只是在研究江西地區HLA-B27亞型方面所做的初步探索，我們本次研究對HLA-B27陽性的AS患者和HLA-B27健康攜帶者進行PCRSBT高分辨基因分型，結果發現江西地區納入本研究的AS患者亞型只有B*2704和B*2705兩種亞型，分別占83.51%和16.49%（見表1），未檢測到其它亞型，可能是樣本數量不夠大的原因；其中與廣西、廣東、閩南地區和上海等地類似以B*2704分布最廣，不同于河南和山東地區的以B*2705最多見，可見不同地區、不同人群的AS患者，HLA-B27各亞型分布頻率存在差異性[4-10]。22例HLA-B27攜帶者健康對照組檢出5種亞型：B27*02亞型1例（4.5%），B27*03亞型 1例（4.5%），15例 B27*04亞型 1例 （68.18%），B27*06亞型 1例 （4.5%），B27*07亞型4例（18.18%）。本研究結果顯示不論在AS患者組、對照組中，兩者均以B*2704為最優勢亞型，兩組中的亞型構成差異無統計學意義。另外發現AS患者中B*2704和B*2705的頻率明顯高于正常人，提示該等位基因是江西人群發生AS的危險基因，而AS患者中B*2707的頻率明顯低于正常人（表1），提示B*2707有可能為一種保護性基因，這與程四國等報道相符一致。中國不同地區HLA-B*2704和HLA-B27*05的分布頻率在各地區間存在一定的差異。從表2的數據分析發現，HLA-B27*04亞型百分率在中國地理上由北向南具有逐漸遞增趨勢，而HLA-B27*05亞型的分布趨勢則相反。因此，依據我們此次試驗結果我們認為江西地區AS就診患者HLA-B*27亞型是HLAB27*04和HLA-B 27*05兩種亞型，并以HLA-B*2704為主。且HLA-B 27*05亞型誘發AS的發病風險高于HLA-B 27*04亞型。

綜上所述，本研究發現AS患者中B27的陽性率為100%，而健康對照人群中B27陽性率為2.2%，這與既往研究結果相符[19，20]。通過對AS患者及健康對照人群HLA-B27分型研究發現了本地區HLA-B27基因主要致病亞型和可能的保護亞型，對于癥狀體征不典型患者和疑難患者的診斷和鑒別診斷具有一定價值。但由于檢測病例數量有限，后續將進一步開展這方面的工作，為本地區臨床對AS患者的及時診斷、控制病情發展提供參考依據。

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R446.62，Q523

A

1674-1129(2017)05-0664-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.009

江西省科技廳課題項目：2013ZBAB205010

何華慶，男，1978年生，主管技師，微生物學碩士，Email：hehuaqing@126.com

2016-11-02；

2017-08-04)