2016年福建省永安及南平監測點五種致瀉性大腸埃希菌監測分析

鄭恩惠 ，林杰 ，李曲文 ，楊勁松 ，陳愛平 ，2

(1、福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001；2、福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建 福州 350001)

2016年福建省永安及南平監測點五種致瀉性大腸埃希菌監測分析

鄭恩惠1，林杰1，李曲文1，楊勁松1，陳愛平1，2

(1、福建省疾病預防控制中心，福建 福州 350001；2、福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建 福州 350001)

目的 對福建永安及南平兩個檢測哨點2016年的281份腹瀉病例進行5種致瀉性大腸埃希菌病原檢測，為病例的確診及致瀉性大腸埃希菌流行病學的提供實驗數據。方法收集281份其他感染性腹瀉病例(排除霍亂、菌痢、傷寒副傷寒)的糞便標本，接種麥康凱平板，選取初步生化符合大腸桿菌的菌落，然后用致瀉性大腸埃希菌多重PCR和單重PCR檢測方法確定其致病型別。結果 281份腹瀉病例糞便標本共檢出致瀉性大腸埃希菌17株，檢出率6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株，其他型別未檢出。結論 福建地區致瀉性大腸埃希菌致病型別以aEPEC，ETEC，EAEC為主，多重PCR檢測方法能有效的對致瀉性大腸埃希菌病進行確診及了解菌株的毒力基因攜帶情況，并為我省的致瀉性大腸埃希菌的流行病學資料的積累及疾病防控提供快速客觀的依據。

感染性腹瀉；致瀉性大腸埃希菌；毒力基因

感染性腹瀉是臨床常見的一種癥狀，常見的病因有細菌、病毒、寄生蟲等不同病原體引起[1]，在細菌感染性腹瀉中，致瀉性大腸埃希菌也是其中的一種。大腸埃希菌(Escherichia coli，E coli)是人腸道中正常菌群，只有少數具有致病性，其致瀉性主要取決是否攜帶有相應的毒力基因，根據毒力、致病性及流行病學等可將致瀉性大腸埃希菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）可分為 5 類，即腸產毒性大腸埃希菌（ETEC）、腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、腸侵襲性大腸埃希菌 （EIEC）及腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）[2]。由于致瀉性大腸埃希菌可通過食物、水源等方式傳播，有可能導致疫情暴發，為此開展腹瀉病例中5種致瀉性大腸埃希菌的監測工作，對于了解其流行病學特征、臨床研究及疾病防控具有一定的研究意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來源根據2016年福建省其他感染性腹瀉(排除霍亂、菌痢、傷寒副傷寒)監測方案采集了281份腹瀉病例糞便，其中福建省南平市延平區疾病預防控制中心156份和福建省永安市疾病預防控制中心125份，初步鑒定均為大腸埃希菌的菌株。

1.2 試劑和儀器五種致瀉大腸埃希菌多重PCR檢測試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為BioAsia進口分裝品，DL2000 DNA Marker（批號：B7501A）購自寶生物工程 （大連）有限公司；PCR擴增儀為G-Storm（英國 Gene Technologies公司），Basic電泳儀，凝膠成像分析系統為Molecular Imager Gel Doc XR System（美國Bio-Rad公司）。

1.3 實驗方法將分離的菌株接種在普通營養瓊脂上37℃，培養18～24h，每個平板挑起3個單克隆菌落加100μl滅菌雙蒸水中混勻，煮沸10min，10000r/min離心5min，取上清做為PCR檢測的DNA模板，多重及單重PCR的反應體系及擴增程序嚴格按試劑盒操作說明書進行。

2 結果

2.1 菌株的多重PCR圖譜結果 見圖1。

2.2 檢出的致瀉性大腸埃希菌情況 281份糞便標本的檢出17株致瀉性大腸埃希菌，陽性率為6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株。（見表 1）。

3 討論

致瀉性大腸埃希菌(DEC)是一類能引起腹瀉的重要病原菌，近年來由致瀉大腸埃希菌(DEC)引發的食物安全成為人們關心一個重要公共衛生問題。因此對DEC的快速診斷顯得尤為重要，但由于DEC與普通大腸埃希菌在表型上無明顯差異，用傳統的培養和生化分型方法無法有效進行區分鑒別是否為DEC。隨著現代分子生物學技術的發展，利用多重PCR對致瀉性大腸埃希菌種屬鑒定（uidA 基因）和毒力基因（escV、bfpB、stx1、stx2、estⅠa、estⅠb、elt、invE、astA、aggR、pic）進行檢測，能有效提高DEC的確診。本文對281份糞便標本分離的大腸埃希菌進行致瀉性大腸埃希菌檢測，共檢出17株DEC，陽性率為6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株，EHEC和EIEC未檢出。國內外文獻報道DEC陽性分離率為4.06%-12.0%不等[3-6]。優勢菌群也不完全一樣，如北京和山西以EPEC為主，而浙江地區主要為EAEC，墨西哥和巴西以EAEC為主，秘魯以EHEC為主，不同國家不同地區優勢菌型不盡相同，可能與環境衛生條件、經濟狀況以及飲食結構不同有關[7-9]。

圖1 多重PCR圖譜結果

表1 檢出的致瀉性大腸埃希菌情況

致瀉性大腸埃希菌(DEC)多重PCR主要根據毒力基因進行鑒別，其設計引物的同時加入了uidA基因，是大腸埃希菌的屬共同基因，然后再根據EPEC （escV和bfpB同時陽性為典型EPEC，escV陽性但bfpB陰性為不典型EPEC，但stx1、stx2均為陰性結果）、EHEC(escV、stx1、stx2 中有一條或者一條以上陽性）、ETEC(estⅠa、estⅠb、elt中有一條或者一條以上陽性)、EIEC(invE)、EAEC(astA、aggR、pic中有一條或者一條以上陽性)，若毒力基因陽性，判斷為致瀉性大腸埃希菌(DEC)。本文中分離到4株 aEPEC 即非典型 EPEC （escV+、bfpB-、stx1-、stx2-），而典型 EPEC（escV+、bfpB+、stx1-、stx2-）沒有分離到，非典型EPEC也是近年來我省分離到比較多的 DEC 型別[4，9，13]，4 株 aEPEC 中有 3 株來自于小于1歲的嬰幼兒。6株ETEC均為毒力基因elt陽性，以成年人為主要感染者。而7株EAEC中各有3株分別為毒力基因aggR和pic單獨陽性，有1株為aggR和pic混合陽性，毒力基因的陽性分布差異是否與臨床癥狀相關，值得在今后進一步加大樣本量深入研究[10-12]。

本次監測結果顯示17例致瀉性大腸埃希菌(DEC)感染中，年齡分布中最小為4個月，最大為80歲，其中有8例為小于3歲的嬰幼兒腹瀉感染者，有3例大于60歲感染者，表明嬰幼兒及老年人是DEC易感人群，應該加強健康教育及成為重要監測對象。17例病例均為6-9月份發現，表明夏秋季節是加強致瀉性大腸埃希菌監控的時期[14-16]。

利用多重PCR能有效的監測其他感染性腹瀉病例中致瀉性大腸埃希菌感染情況，能快速檢測其菌型分布及毒力基因攜帶情況，為掌握流行菌型變遷，為防控致瀉性大腸埃希菌疫情提供快速客觀的依據。

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R446.5，R378.2+1

A

1674-1129(2017)05-0671-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.011

福建省衛生廳醫學創新課題（2011-CXB-19)

鄭恩惠，1987年生，檢驗技師，本科，從事病原微生物檢驗，郵箱：450279983@qq.com

陳愛平，副主任醫師，Email：cap2006@live.cn

2017-03-02；

2017-08-04)