循環(huán)免疫復(fù)合物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用價(jià)值研究

劉坦 ，趙星鵬 ，張忠新 ，孟曉峰

(1、鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 洛陽471000；2、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

循環(huán)免疫復(fù)合物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用價(jià)值研究

劉坦1，趙星鵬1，張忠新2，孟曉峰1

(1、鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 洛陽471000；2、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的 檢測RF、CCP與CIC-C1q在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、其他關(guān)節(jié)炎與正常志愿者血清中的水平，比較循環(huán)免疫復(fù)合物（Circulating immune complex，CIC）與RF、CCP在RA中的檢測能力，進(jìn)而評(píng)估CIC在RA中的診斷價(jià)值。方法 臨床上收集RA患者、其他關(guān)節(jié)炎患者和正常志愿者各60人的血清，通過膠乳免疫增強(qiáng)法、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和C1q固相ELISA法分別檢測血清中三個(gè)指標(biāo)（RF、CCP、CIC-C1q）的水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 RF在RA 患者組、其他關(guān)節(jié)炎患者組、正常志愿者三組中的濃度分別為：117.17±11.08IU/ml、21.42±4.66IU/ml、7.65±0.64IU/m l，CCP水平在三組中分別為：545.64±93.74AU/ml、13.21±3.32AU/m l、5.08±0.66AU/m l，CIC-C1q 水平在三組中分別為：136.47±15.25ng/m l、89.67±13.85ng/m l、27.64±2.27ng/ml。 CIC-C1q 水平在三組間兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.0001），運(yùn)用 ROC 曲線對三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析得出在三個(gè)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測時(shí)特異度和靈敏度都最好。結(jié)論 CIC在RA的診斷中有一定的價(jià)值，將其與CCP、RF聯(lián)合檢測能提高RA診斷的靈敏度與特異度，并在RA與其他關(guān)節(jié)炎的鑒別診斷中也存在一定價(jià)值。

RF；CCP；循環(huán)免疫復(fù)合物；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性致畸性疾病，以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鳎浠颊哐鍍?nèi)高濃度的類風(fēng)濕因子，能與免疫球蛋白IgG結(jié)合形成過剩的免疫復(fù)合物（Immune complex，IC），隨著血液循環(huán)，沉積于關(guān)節(jié)滑膜、皮下組織等處引起滑膜炎，這是RA患者關(guān)節(jié)病變的直接原因。RA實(shí)驗(yàn)室檢查的常規(guī)項(xiàng)目主要是類風(fēng)濕因子（Rheumatoid factor，RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體 （Anti cyclic citrullinated peptide antibody，CCP）等，而從RA的病理過程中發(fā)現(xiàn)的循環(huán)免疫復(fù)合物（Circulating immune complex，CIC）在 RA 的發(fā)生發(fā)展中起著直接的作用，并且近年來關(guān)于CIC在自身免疫性疾病中作用的研究也越來越多[1-3]，普遍認(rèn)為CIC的形成不僅參與了機(jī)體T細(xì)胞與B細(xì)胞的免疫應(yīng)答，也通過補(bǔ)體的經(jīng)典激活途徑，啟動(dòng)了炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在自身免疫性疾病的炎癥進(jìn)展中起到重要作用，因此，本研究擬通過收集臨床上確診為RA的患者血清，檢測血清中RF、CCP、CIC的水平，并評(píng)價(jià)CIC在診斷RA中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的收集收集2014年6月至2015年6月在洛陽市中心醫(yī)院就診并確診為RA的患者，其中男性22例，女性38例，年齡16～88歲，平均年齡53.09±16.55歲。該組所有病例均符合2010美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)ARA修訂的RA診斷分類標(biāo)準(zhǔn)[4]。其他關(guān)節(jié)炎組為同期我院就診患者，其中包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎16例，骨性關(guān)節(jié)炎26例，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎13例，其他關(guān)節(jié)炎5例，共計(jì)60例。該組男性15例，女性45例，年齡26～75歲，平均年齡54.00±11.12歲。正常志愿者為在同期我院健康體檢人群中隨機(jī)抽取。共60例，其中男性27例，女性33例，年齡25～68歲，平均年齡42.62±10.87歲。

1.2 主要試劑類風(fēng)濕因子檢測試劑盒、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體測定試劑盒與人免疫循環(huán)復(fù)合物C1q（CIC-C1q）ELISA檢測試劑盒分別購買自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司，深圳亞輝龍生物科技有限公司和美國RD公司。

1.3 方法

1.3.1 RF水平的檢測 RF試劑盒的運(yùn)用的是膠乳凝集試驗(yàn)的原理。采集患者清晨空腹血，離心，分離血清之后上機(jī)檢測得出結(jié)果 （所用儀器：日立7600全自動(dòng)生化分析儀；RF試劑批號(hào)：20150309）。 結(jié)果判斷： 參考范圍為 0～20IU/ml，＞20IU/ml判為陽性。

1.3.2 CCP與CIC-C1q水平的檢測 CCP試劑盒與CIC-C1q試劑盒均采用的是間接酶聯(lián)免疫法（ELISA）。采集患者清晨空腹血，離心，按照ELISA的方法，同時(shí)設(shè)置陰性對照孔、陽性對照孔和系列標(biāo)準(zhǔn)品濃度。CCP標(biāo)準(zhǔn)品濃度（AU/ml）：0，25，50，200，80，3200；CIC-C1q 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/m l）：0，15，30，60，120，240。 最終顯色后，通過鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)的PHOMO酶標(biāo)儀分別檢測其吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出CCP和CIC-C1q的血清濃度。結(jié)果判斷：CCP參考范圍為0～25AU/ml，由于CIC-C1q本試劑盒為科研用試劑盒，不能用于臨床診斷，故本試劑盒沒有參考范圍。其最低檢測濃度小于1.0ng/ml。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，對三組間RF、CCP和CIC-C1q水平運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用GraphPad Prism軟件作圖在三組間進(jìn)行兩兩比較，對三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測的價(jià)值運(yùn)用ROC曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 三個(gè)檢測指標(biāo)在三組間的結(jié)果比較 RA患者/其他關(guān)節(jié)炎患者與正常志愿者三組血清中RF、CCP和CIC-C1q的水平見表1。其中RF與CCP水平在RA患者血清中明顯升高，與正常對照組比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.0001，圖 1-A.B），但在其他關(guān)節(jié)炎患者血清中水平與正常志愿者之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.4268，圖1-A和P=0.8666，圖1-B）。血清中CIC-C1q水平在RA患者與其他關(guān)節(jié)炎患者血清中均明顯升高，三組間兩兩比較均具有顯著差異（P＜0.0001，圖 1-C）。

表1 RF、CCP、CIC-C1q在三組血清中的濃度

2.2 運(yùn)用ROC曲線分析三個(gè)指標(biāo)在RA診斷中的價(jià)值分析結(jié)果顯示，RF、CCP、CIC-C1q三個(gè)指標(biāo)在RA患者診斷中均有很大的價(jià)值（表2，圖2），兩兩聯(lián)合檢測時(shí)，其特異性與靈敏度均得到很大提高（特異性在RF與CCP聯(lián)合時(shí)最高，可達(dá)0.966，靈敏度在CCP與CIC-C1q聯(lián)合時(shí)最高，達(dá)0.869），三者聯(lián)合時(shí)，彌補(bǔ)了CCP與RF聯(lián)合檢測的低靈敏度，RF與CIC-C1q聯(lián)合檢測低特異度的缺點(diǎn)。特異性和靈敏度都較好，分別為0.908和0.855（表 2，圖 3）。

3 討論

圖1 RF、CCP、CIC-C1q三個(gè)指標(biāo)在三組間的比較

表2 RF/CCP/CIC-C1q三種指標(biāo)在RA診斷中的特異性與靈敏度

圖2 RF、CCP、CIC-C1q三種指標(biāo)在RA診斷中的價(jià)值

圖3 RF、CCP、CIC-C1q三種指標(biāo)在RA診斷中的聯(lián)合檢測

正常情況下，機(jī)體防御系統(tǒng)作為清除異物抗原的一種方式，清除體內(nèi)的免疫復(fù)合物，但某些情況下體內(nèi)形成的免疫復(fù)合物不能夠被清除，沉積于于機(jī)體的某一部位，如皮膚/血管壁及臟器，形成局部免疫復(fù)合物；也有部分游離于體液中，稱為可溶性免疫復(fù)合物；隨血液循環(huán)的稱為循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）。其形成后通過與血液中的補(bǔ)體成分，細(xì)胞上的Fc受體，補(bǔ)體受體進(jìn)一步結(jié)合反應(yīng)，可參與機(jī)體的病理性損傷，最終形成免疫復(fù)合物病。CIC的檢測方法目前也比較多，如PEG沉淀法、C1qELISA法、Western blot法等。本研究選用C1q固相ELISA法來檢測血清中CIC-C1q水平，因C1q固相法在敏感性、特異性、重復(fù)性等方面都體現(xiàn)出較好的優(yōu)點(diǎn)[5]。

自身免疫性疾病就是一種免疫復(fù)合物病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、干燥綜合征（SS）等都是比較典型的自身免疫性疾病，近期關(guān)于CIC在SLE和SS的發(fā)病過程以及診斷中的研究有很多[6-10]。普遍認(rèn)為，CIC在SLE與SS等自身免疫性疾病的診斷中有著重要作用，也反映了疾病的進(jìn)展與預(yù)后。RA也是一種自身免疫性疾病，在RA患者體內(nèi)，當(dāng)自身變性的IgG與類風(fēng)濕因子結(jié)合后，形成免疫復(fù)合物，反復(fù)沉積于小關(guān)節(jié)滑膜時(shí)即可引起類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。最近，隨著大量CIC在RA患者診斷中的研究的出現(xiàn)[11-14]，大家更加重視CIC在疾病診斷，治療以及疾病進(jìn)展與預(yù)后中的作用。因此進(jìn)一步研究循環(huán)免疫復(fù)合物在RA的診斷/發(fā)病機(jī)制中的作用，在疾病的預(yù)后估計(jì)、病情活動(dòng)性觀察以及療效判斷中有著重要意義。

目前RA的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、X線以及常規(guī)的血清學(xué)檢測。但是RA患者早期的就診癥狀多為小關(guān)節(jié)滑膜炎所致的關(guān)節(jié)腫痛，因此其與其他關(guān)節(jié)炎疾病的鑒別診斷就很重要。RF是目前診斷RA最常用的血清學(xué)指標(biāo)，RF敏感性較高，特異性較差，在RA以外的其他自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、干燥綜合征（SS）等患者，抑或其他非自身免疫性疾病如腫瘤等疾病血清中也存在一定的陽性率。因此單獨(dú)用RF診斷存在一定的漏診率，對于疾病早期診斷有一定困難。但RF水平在RA的嚴(yán)重程度以及預(yù)后中有很大價(jià)值。抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）是環(huán)狀聚絲蛋白的多肽片段，抗CCP抗體在RA的早期診斷和進(jìn)展標(biāo)志有較好的應(yīng)用前景[15-18]。抗CCP抗體主要是IgG類抗體，對RA的特異性約為96%，但其靈敏度較低，在RA的早期階段即可出現(xiàn)陽性，具有較高的陽性預(yù)報(bào)道，但仍然存在漏診的可能[19，20]。因此，抗 CCP抗體和RF水平的聯(lián)合檢測對RA的診斷及預(yù)后有很大的意義[21]。RA作為一種免疫復(fù)合物病，CIC在其發(fā)生發(fā)展中必然起到一定作用。近年來關(guān)于CIC與自身免疫性疾病的研究越來越多，越來越清晰。普遍認(rèn)為CIC通過經(jīng)典補(bǔ)體激活途徑參與炎癥的發(fā)生發(fā)展，其在RA的發(fā)展與預(yù)后中也具有很大價(jià)值。而本研究也進(jìn)一步說明，CIC在RA的診斷中也有較好的診斷價(jià)值，較高的特異性與靈敏度，特別是CIC與RF、CCP的聯(lián)合檢測，提高了檢測的靈敏度與特異度，這也將給RA的早期診斷、疾病監(jiān)測、疾病預(yù)后以及RA的鑒別診斷提供更可靠的實(shí)驗(yàn)室支持。

本研究通過數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，CIC-C1q與RF都是RA檢測的非特異性的指標(biāo)，CIC的特異性更差一些，但其水平高低在三組之間均存在顯著差異，并且將CIC-C1q、RF、CCP三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用，在RA的診斷上具有良好的診斷價(jià)值，三者聯(lián)合使得RA的檢出率大大提高，相較于CCP與RF的聯(lián)合檢測增加了RA檢出的靈敏度，且仍然保持較好的檢測特異性。因此，RF、CCP、CIC-C1q三者聯(lián)合檢測不僅對RA的早期診斷有很大幫助，而且對RA與其他關(guān)節(jié)炎類疾病的區(qū)分有很好的提示作用。

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Study on the value of circulating immune com plexes in rheumatoid arthritis

LIU Tan1，ZHAO Xingpeng1，ZHANG Zhongxin2，MENG Xiaofeng1.
1.Department of Clinical Laboratory，Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang Henan 471000，China；2.College of Medical Laboratory，Xinxiang Medical University，Xinxiang Henan 453003，China.

Objective To detect the level of serum RF，CCP and CIC-C1q in rheumatoid arthritis(RA)patients，other arthritis patients and normal volunteers，the detection ability and diagnostic value of CIC in RA was compared and evaluated.M ethods The clinical data of 60 patients with RA，other arthritis patients and normal volunteers were collected，respectively.The level of three indexes(RF，CCP and CIC-C1q)in serum weremeasured by latex immunoassay，indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and C1q solid phase ELISA.All data was analyzed by statistical tools.Results The concentration of RF in three groups(RA，other arthritis patients and normal volunteers)were 117.17±11.08IU/ml，21.42±4.66IU/ml，7.65±0.64IU/ml，respectively.The level of CCPwere 545.64±93.74AU/ml，13.21±3.32AU/ml，5.08±0.66AU/ml，respectively.And the level of CIC-C1q were 136.47±15.25ng/ml，89.67±13.85ng/ml，27.64±2.27ng/ml，respectively.There was significantly difference in the level of CIC-C1q among three groups（P＜0.0001).The ROC curve showed that the specificity and sensitivity of these three indexeswere best.Conclusion CIC has a certain value in the diagnosis of RA，and combined with CCPand RF can improve the sensitivity and specificity of RA diagnosis，with a great value in the differential diagnosis between RA and other arthritis.

RF；CCP；Circulating immune complex；Rheumatoid arthritis

R593.22，R446.62

A

1674-1129(2017)05-0680-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.014

劉坦，女，1983年生，醫(yī)學(xué)碩士，主管技師，從事自身免疫研究工作。

2017-04-07；

2017-08-05)