江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感實驗室診斷與分析

孫愛猛，王平興，周信云，劉麗，吳珺，朱端昊

(吉安市疾病預(yù)防控制中心，江西 吉安 343000)

·調(diào)查報告·

江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感實驗室診斷與分析

孫愛猛，王平興，周信云，劉麗，吳珺，朱端昊

(吉安市疾病預(yù)防控制中心，江西 吉安 343000)

目的 通過real-time RT-PCR對江西省首起聚集性人感染H7N9禽流感病例進行實驗室診斷與分析，進一步提高實驗室對人感染禽流感的檢測能力。方法 采集人感染H7N9禽流感病例咽拭子并提取RNA，分別采用流感甲/乙型通用引物、季節(jié)性流感特異性引物（H1N1、H3N2、H1N1pdm）、禽流感特異性引物（H5、H7、N9、H9、H10）進行 real-time RT-PCR 檢測。結(jié)果 患者A甲型流感、禽流感H7、N9核酸擴增結(jié)果均為陽性；患者B（患者A的母親）甲型流感、禽流感H7核酸擴增結(jié)果均為陽性。結(jié)論 經(jīng)江西省疾控中心流感實驗室復(fù)核，患者A與患者B均感染H7N9禽流感病毒，為江西省首起人感染H7N9禽流感病毒聚集性病例。

禽流感H7N9；聚集性病例；實驗室診斷

2013年3月，我國東部地區(qū)出現(xiàn)不明原因重癥肺炎病例，后經(jīng)國家流感中心確證為新型人感染H7N9禽流感病例[1]。流感病毒為單股負鏈RNA病毒，基因組大小約為 14kb，由 HA、NA、NP、PA、PB1、PB2、M、NS八個片段所組成。研究表明新型H7N9禽流感病毒是由多種禽流感病毒重配所產(chǎn)生的，其HA基因可能來自于野鴨中的禽流感H7N3，NA基因來自于東亞遷徙候鳥中的禽流感H7N9，余下六個片段來自于禽流感 H9N2[1，2]。 人感染H7N9禽流感引起的臨床癥狀主要有高熱、咳嗽、肌肉酸痛、呼吸窘迫進而導(dǎo)致重癥肺炎[1，3]；聚集性病例的出現(xiàn)提示新型禽流感病毒在人際間可能進行有限的傳播[4-7]。目前針對其檢測方法主要有分子生物學(xué)檢測、血凝抑制試驗與病毒培養(yǎng)等[8]；本研究對江西省2例輸入性不明原因肺炎患者咽拭子進行實驗室檢測，最終確診兩位患者為人感染H7N9禽流感聚集性病例，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患者基本情況患者A，男，23歲；患者B，43歲，兩者為母子關(guān)系。2016年4月8日前均居住在福建某地；2016年3月25日患者A在活禽市場有購買禽肉史，禽肉為現(xiàn)宰現(xiàn)賣，且當(dāng)天患者A、B均有禽肉加工史。患者A于2016年4月1日發(fā)病，患者B于2016年4月5日發(fā)病，發(fā)病后在當(dāng)?shù)卦\所接受治療，2016年4月8日兩例患者由福建返回江西繼續(xù)接受治療。

1.1.2 樣本 2016年4月15日以不明原因肺炎病例采集兩例患者咽拭子樣本低溫送至吉安市流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室進行檢測。兩例患者經(jīng)上級部門確證為人感染H7N9禽流感病例后按照人感染H7N9禽流感疫情防控方案（第三版）開展聚集性病例的強化監(jiān)測，采集密接者等人群咽拭子標(biāo)本低溫送至吉安市流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室進行檢測。

1.1.3 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒、A/B流感通用型核酸檢測試劑盒、季節(jié)性流感檢測試劑盒（H1N1、H3N2、H1N1pdm）、禽流感核酸檢測試劑盒（H5、H7、N9、H9、H10） 均購自中山大學(xué)達安基因公司，所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.1.4 主要儀器 ABI7300熒光PCR儀、振蕩器等

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸提取提取病毒核酸在生物安全II級（BSL-2）實驗室的生物安全柜內(nèi)進行，提取方法按試劑盒說明書進行。

1.2.2 Real-time PCR檢測甲/乙型流感、季節(jié)性流感 （H1N1、H3N2、H1N1pdm）、 禽流感（H5、H7、N9、H9、H10）核酸檢測及判定標(biāo)準均按試劑盒說明書進行操作。擴增條件均為：50℃ 15min，1 cycle；95℃，15min，1 cycle；94℃，15s～58℃，45s，45 cycle。

1.2.3 質(zhì)量控制陰性質(zhì)控品無明顯擴增曲線；陽性質(zhì)控品有明顯擴增曲線，且Ct值≤30；以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則本次實驗無效。陰陽性質(zhì)控品由試劑盒自帶。

2 結(jié)果

2.1 患者咽拭子檢測結(jié)果使用通用型甲/乙流感、季節(jié)性流感 （H1N1、H3N2、H1N1pdm）、 禽流感（H5、H7、N9、H9、H10） 核酸檢測試劑盒對提取的病毒核酸進行real-time PCR檢測，結(jié)果為患者A甲型流感、禽流感H7、N9核酸擴增結(jié)果均陽性；患者B甲型流感、禽流感H7核酸擴增結(jié)果均陽性，其余均為陰性，擴增結(jié)果及Ct值見表1和圖1～3。

2.2 密接者及強化監(jiān)測結(jié)果對采集密接者及強化監(jiān)測的55份咽拭子樣本進行real-time PCR進行檢測，共檢測到乙型流感14份，甲型流感通用性核酸檢測均為陰性。

表1 H7N9 real-tim e PCR檢測結(jié)果

圖1 甲型流感核酸通用性檢測

圖2 新型H7N9 H7亞型檢測

圖3 新型H7N9 N9亞型檢測

3 討論

病毒侵入宿主細胞需要借助宿主細胞受體才能完成，流感病毒HA受體結(jié)合位點的氨基酸序列決定了病毒對禽與人的結(jié)合傾向。禽流感病毒在禽類中的宿主受體為SAα-2，3 Gal受體，人上呼吸道黏膜上皮細胞以SAα-2，6 Gal受體為主，下呼吸道以 SAα-2，3Gal受體為主[9]，以往有研究表明禽流感H7能夠感染人引起輕微的呼吸道癥狀[10]，N9感染人尚屬首次；從禽類和人分離到的H7N9病毒在 HA區(qū)域存在G186V、Q226L、A138S氨基酸替換，這可能導(dǎo)致禽流感對人宿主受體結(jié)合力的增加，從而導(dǎo)致跨種屬傳播的發(fā)生[11]。Ding H等人研究證明新型H7N9禽流感病毒在人際間可能存在有限的人際間傳播[4-7]；本研究中患者A、B雖然均有禽肉加工史，但并不能完全排除人際間傳播的可能性，需要進一步的排除與驗證。研究證明H7N9禽流感PB2蛋白發(fā)生Q591R和E627K能夠明顯增強對小鼠的致病性以及病毒在哺乳動物的適應(yīng)性[12]。郭曉蘭在對人感染H7N9禽流感輕重病例病毒全基因組序列分析中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵氨基酸位點E627K突變存在差異[11]；與以往人感染H7N9發(fā)生重癥肺炎多見于年齡偏大的患者不同，患者A為青年患者且自身無基礎(chǔ)性疾病，4月8號收治入院后立即使用達菲開始治療，4月15日因病情持續(xù)加重轉(zhuǎn)上級醫(yī)院繼續(xù)治療，分析導(dǎo)致該患者病情加重的原因可能為病毒毒力基因發(fā)生改變，從而導(dǎo)致為致病力增強[13]。下一步需要對病毒相關(guān)序列進行測序，并對其耐藥性基因及毒力基因進行分析。

研究表明人感染H7N9禽流感檢測過程中下呼吸道樣本的陽性檢出率要高于上呼吸道[14]；本研究中兩例樣本real-time PCR檢測的Ct值均接近判斷閾值，其主要原因可能是樣本來自于上呼吸道，且患者發(fā)病時間較長，此時上呼吸道樣本中病毒拷貝數(shù)偏低；這提示在后期日常傳染病監(jiān)測過程中需要進一步加強采樣相關(guān)知識及技能的培訓(xùn)，保證檢測樣本的質(zhì)量。Sun Y研究表明提取H7N9禽流感病毒核酸時，HA與NA核酸拷貝數(shù)有差異，導(dǎo)致real-time PCR檢測過程中HA的檢出率要高于NA的檢出率；本研究中患者B咽拭子樣本中檢出H7亞型，N9亞型未檢出，這與Sun Y研究相符[15]；結(jié)合實際工作，后期不明原因肺炎監(jiān)測中可考慮先對敏感性較高的HA基因進行檢測，提高H7N9的檢出率。本研究表明隨著人員貿(mào)易的往來，新發(fā)傳染病不再局限于某一區(qū)域，隨時都存在輸入性的風(fēng)險，需要提高警惕并加強監(jiān)測，做到及時、準確的發(fā)現(xiàn)并控制傳染病。

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2017-08-01；

2017-09-13)