大鼠脂肪干細胞成骨誘導分化能力的影響實驗研究

姜健 秦書儉

了解ADSCs的體外生長規律、生物學特性及成骨誘導分化能力的各種參數，已經成為目前急需解決的問題。本研究通過探討ADSCs的生長增殖活性以及成骨分化能力，為ADSCs是否可以成為理想的種子細胞以及進一步基礎研究和臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 健康SD大鼠，由遼寧醫學院動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs分離及原代、傳代培養 取SD大鼠，無菌條件下取腹股溝部脂肪組織，常規方法沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養基制成單細胞懸液，置37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中常規培養。原代培養每3 d換液。待細胞生長達到80%時，進行1∶2傳代，繼續培養傳代。

1.2.2 貼壁細胞鑒定 取第2代的ADSCs，按照試劑盒說明進行免疫細胞化學染色，分為4份，分別滴加兔抗鼠CD34、CD44、CD49 d、CD106一抗。用SABC顯色試劑盒顯色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.3 成骨誘導培養及指標檢測 取第3代細胞，分別以1×104/mL的密度接種于24孔培養板、5×104/mL的密度接種到放有蓋玻片的6孔培養板中，更換為含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L 抗壞血酸的成骨誘導劑的DMEM培養基，每3 d換液。以加入不含誘導劑培養基的3代細胞作為對照組。

1.3.1 形態學觀察 每日在顯微鏡下觀察誘導后細胞的生長情況以及形態特點。

1.3.2 茜素紅染色礦化結節計數 取成骨誘導21 d的細胞，0.1%茜素紅染色30 min，鏡下觀察照相。將每孔均分為4個象限，每個象限隨機取一低倍2個視野，取8視野計數均值。

2 結果

2.1 貼壁細胞鑒定 對第2代貼壁細胞通過免疫細胞化學染色檢測了CD34、CD44、CD49 d、CD106四個細胞表面標記，結果顯示貼壁細胞CD44、CD49 d陽性表達，細胞胞漿呈現棕黃色;而CD34、CD106為陰性表達，大部分細胞胞漿未著色，細胞核藍染。說明貼壁細胞為ADSCs，而非造血干細胞和BMSCs。

2.2 成骨能力檢測結果

2.2.1 形態學觀察 細胞在成骨誘導后，生長速度明顯變慢，細胞形態變化相似，逐漸由梭形變為立方形、三角形、多角形，有數個突起。

2.2.2 礦化結節染色 成骨誘導21 d，細胞鈣結節形成明顯，經茜素紅染色出現紅色結節的陽性染色(圖1)，不加誘導劑的對照組染色為陰性(圖2)。

圖1 礦化結節陽性染色(×100)

圖2 對照組礦化結節染色陰性(×100)

3 討論

本實驗中從脂肪組織獲取的單個核細胞，經過貼壁培養，貼壁細胞表面表達CD44、CD49 d陽性;而CD34、CD106為陰性表達。CD34作為造血干細胞標志性免疫表型，CD34陰性說明貼壁細胞并非來源于血液循環中的干細胞［1］，同時說明細胞未受到脂肪組織中微血管內皮細胞的污染;有研究顯示ADSCs與 BMSCs都可表達 CD44［2］;CD49 d在 ADSCs中為陽性表達，在BMSCs中則為陰性表達;而與CD106則相反;本實驗CD106陰性表達，已經排除BMSCs污染的可能。以上結論說明已經得到純度較高的ADSCs。CD49 d是調節造血干細胞和祖細胞定居歸巢到骨髓的表面分子，CD106是調節造血干細胞和祖細胞從骨髓中向外遷移的表面分子，CD49 d與CD106是ADSCs與BMSCs很好的區別標記［3］，但其本質有待進一步的研究。

礦化結節是體外培養條件下成骨細胞鑒定的一個重要指標，也是直接反應干細胞成骨分化能力的一項指標。ADSCs誘導21 d后經茜素紅鈣結節染色，均出現紅色結節的陽性表達。

［1］Civin CI，Banquerigo ML，Strauss LC，et al.Antigenic analysis of hematopoiesis.VI.Flow cytometric characterization of My-10-positive progenitor cells in normal human bone marrow.Exp Hematol，1987，15(1):10-17.

［2］Katz AJ，Tholpady A，Tholpady SS，et al.Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal(hADAS)cells.Stem Cells，2005，23(3):412-423.

［3］Gronthos S，Franklin DM，Leddy HA，et al.Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells.J Cell Physiol，2001，189(1):54-63.