菜心受小菜蛾取食前后的碳水化合物和蛋白組代謝變化

羅海玲，康紅衛，馬 俊，琚茜茜，張 力，史衛東*

(1．廣西農業科學院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西 南寧 530007； 3.廣西大學農學院，廣西 南寧 530005；4.廣西南寧市委黨校，廣西 南寧 530007)

菜心受小菜蛾取食前后的碳水化合物和蛋白組代謝變化

羅海玲1,2,3，康紅衛1，馬 俊4，琚茜茜1，張 力1，史衛東1*

(1．廣西農業科學院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西 南寧 530007； 3.廣西大學農學院，廣西 南寧 530005；4.廣西南寧市委黨校，廣西 南寧 530007)

【目的】分析菜心-小菜蛾互作的生理和蛋白組變化規律，為明確菜心對小菜蛾取食的抗蟲信號途徑及防御機理提供理論依據。【方法】以四九菜心四葉幼苗為材料，測定菜心葉片接入小菜蛾24 h前后的碳水化合物代謝變化，并應用串聯質量標簽(tandem mass tag，TMT)標記聯合高效液相色譜-質譜 /質譜法(LCESI-MS/MS)技術鑒定菜心接入小菜蛾24 h前后的差異蛋白組變化。【結果】菜心接蟲后較對照可溶性淀粉積累減少，可溶性蛋白及可溶性糖(包括蔗糖、還原糖)含量增加；本研究共篩選出差異表達蛋白430個(接蟲后較對照上調1.2倍以上的蛋白211個，下調0.83倍以下的蛋白119個)。其中與光合作用合成代謝相關的許多蛋白在小菜蛾取食菜心后下調表達，而與逆境脅迫、糖水解及能量代謝相關的一些蛋白上調表達。【結論】TMT技術能有效地篩選出小菜蛾取食菜心前后的差異表達蛋白，其差異蛋白主要參與生物脅迫、糖代謝、光合作用和呼吸作用的能量及物質的轉化等生物過程。

菜心；小菜蛾；碳水化合物；TMT；差異蛋白

【研究意義】菜心是華南栽培規模最大的蔬菜之一，在華南地區蔬菜的周年供應及出口創匯中有著舉足輕重的作用，但是近年來由于小菜蛾嚴重危害使得菜心的生長和品質遭到嚴重破壞，因此，研究菜心與小菜蛾之間的相互作用，尋找菜心對小菜蛾取食防御相關的蛋白，為從蛋白組水平上明確菜心對小菜蛾取食的抗蟲信號途徑及防御機理奠定基礎，為菜心培育高抗小菜蛾資源及品質改良具有十分重要的意義。【前人研究進展】十字花科植物中存在的異硫氰酸酯化合物為小菜蛾(Plutellaxylostella)幼蟲取食的指示劑，也是吸引成蟲產卵的次生物[1]，因此這些寄主植物受小菜蛾危害嚴重。喻國泉等調查結果表明小菜蛾對寄主的產卵具有選擇性：小菜蛾對芥菜、菜心的嗜好性最大[2]，再加上小菜蛾一年發生代數多，繁殖系數高，導致小菜蛾害蟲猖撅、環境破壞，雖然小菜蛾化學防治方面的研究越來越多，但卻忽視了植物、植物次生物質與害蟲之間的相互作用，目前，應對害蟲取食的自我防御機制及其生物防治研究日益受到人們的重視。菜心在受生物逆境脅迫時，往往會引起植物體內與植物抗逆性相關的生理生化變化[3],產生一系列自我防御機制，而菜心的自我防御機制變化也同樣影響小菜蛾生長發育[4]。張游南等研究表明小菜蛾取食誘導的菜心揮發物含量明顯高于健康菜心釋放的揮發物含量[5]。尹飛等研究表明小菜蛾取食寄主植物2、4、6和8 d后其體內蛋白和糖含量發生明顯變化，以菜心為害2 d后蔗糖升高最為顯著[6]，考慮菜心幼苗對小菜蛾為害的承受能力，及菜心遭受小菜蛾取食后蛋白質組及營養成分變化的時效性，避免不同發育齡期小菜蛾幼蟲對菜心的為害程度的誤差，本研究采用TMT等方法測定三齡小菜蛾幼蟲取食誘導菜心24 h的菜心的蛋白組和碳水化合物代謝變化。串聯質譜標簽(TMT)技術是一種通過串聯質譜試驗方法對不同樣品中的蛋白進行同時鑒定和定量的有力工具[7]。徐瑩等采用TMT 技術對3 個煙草品種葉片差異蛋白進行了有效地分離和鑒定[8]。【本研究切入點】目前，對于植物誘導防御機制研究都是在基因或基因組水平上進行，鮮有從蛋白組學上去研究菜心對小菜蛾取食的相關防御機制。【擬解決的關鍵問題】應用TMT技術分析菜心受小菜蛾取食前后的差異表達蛋白質譜，旨在研究菜心與小菜蛾之間的相互作用，尋找到菜心對小菜蛾取食防御相關的蛋白，為明確菜心對小菜蛾取食的抗蟲信號途徑及防御機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用目前在很多地區都在大規模種植的四九菜心為供試材料，2014年5月1日開始營養缽基質育苗，待菜心長至4葉1心時將菜心幼苗接入三齡小菜蛾幼蟲(每株幼苗放1 頭幼蟲)進行取食，取食24 h后取小菜蛾取食的幼苗葉片及未接蟲的幼苗葉片(CK，圖1)，液氮速凍后儲存于-80 ℃，備用。

1.2 供試蟲源

三齡小菜蛾幼蟲由廣西大學農學院應用昆蟲研究所提供。

1.3 測定項目及方法

蔗糖含量測定采用Roe比色法[9]、還原糖含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸法[10]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250比色法[10]，淀粉含量采用碘比色法測定[11]。菜心接入小菜蛾24 h前后的差異蛋白組變化應用串聯質量標簽標記聯合高效液相色譜-質譜 /質譜法(LC-MS/MS)技術由景杰蛋白有限公司代測，其蛋白提取采用TCA/丙酮沉淀法[12]。提取的蛋白質樣品加入10 mM DTT在37 ℃下還原1 h，室溫黑暗條件下還原烷基化處理45 min，按照 1∶50比例在蛋白質樣品中加入胰蛋白酶，37 ℃的條件下酶解過夜，然后再按1∶100比例加入胰蛋白酶再消化酶解4 h；取100 μg消化酶解的蛋白加入 TMT 標記試劑平衡至室溫，將標記好的樣品，進行液相串聯質譜分析。

圖1 四九菜心幼苗接蟲后24 h和CK的圖片Fig.1 The young leaves after 24 hours the diamondback moth feeding on ‘Sijiu’ Chinese flowering cabbage and CK

1.4 蛋白鑒定及數據庫查詢

質譜數據運用Proteome Discoverer軟件提取譜圖后用MASCOT (v.2.3.0) 搜索引擎中進行蛋白質和肽段鑒定，查詢參數參考NCBI蕓苔屬植物數據庫。

1.5 生物信息學分析

生物信息學分析搜庫后得到表達量差異結果(上調變化倍數>1.2或下調<0.8，P<0.05視為二者之間差異具有統計學意義)，鑒定得到的差異蛋白采用Gene Ontology(GO)功能富集度分析，同時采用STRING 9.0軟件進行差異蛋白的相互作用分析，通過網絡圖(Network)查看并選擇重要的相關互作蛋白進行分析。

1.6 數據統計及處理

試驗數據應用Excel 2007和SPSS l9.0統計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 菜心接蟲24 h后碳水化合物變化

淀粉是光合作用終產物，也是植物體中貯存的養分。淀粉是葡萄糖的高聚體，在淀粉酶等的作用下能夠水解成麥芽糖、葡萄糖。如圖2所示，菜心葉片在接入小菜蛾24 h后可溶性淀粉積累顯著少于對照，下降54.96 %。

圖2 四九菜心接蟲前后可溶性淀粉含量變化Fig.2 Effects of diamondback moth on the soluble starch content of Chinese flowering cabbage

圖3 四九菜心接蟲前后可溶性蛋白含量變化Fig.3 Effects of diamondback moth on the soluble protein content of Chinese flowering cabbage

植物體內的可溶性蛋白質大多數是參與各種代謝的酶類，可溶性蛋白質含量是一個重要的生理生化指標，植物中可溶性蛋白可以反應植物體的總體代謝，在許多外界環境脅迫的條件下，可溶性蛋白往往會增加，使植物適應性增強。如圖3所示，菜心葉片接入小菜蛾24 h后可溶性蛋白較對照升高8.98 %。

在植物中，光合作用的主要產物為葡萄糖和蔗糖，葡萄糖合成為淀粉后可暫時儲藏在葉中，而淀粉受其生長環境的影響由可轉化為麥芽糖和葡萄糖等還原性糖。如圖3所示，菜心葉片接入小菜蛾24 h由于蟲害逆境的影響，其還原糖較對照顯著升高76.37 %。

蔗糖是植物儲藏、積累和運輸糖分的主要形式，廣泛分布于植物體內。蔗糖既是能量儲存的重要形式，也是植物體內重要的信號分子。如圖4所示，菜心接入小菜蛾24 h后，其蔗糖較對照顯著升高了40.12 %。

2.2 菜心接蟲24 h后蛋白組變化

2.2.1 肽段質量有效性驗證 肽段質量驗證圖(圖6)表明，大多肽段質量誤差分布接近0，肽段得分在20分以上(A)，并且大多數肽段長度在8和16間(B)，與胰蛋白酶酶解肽段長度相一致，說明樣品制備符合標準。

圖4 四九菜心接蟲前后還原糖含量變化Fig.4 Effects of diamondback moth on the reducing sugar content of Chinese flowering cabbage

圖5 四九菜心接蟲前后蔗糖含量變化Fig.5 Effects of diamondback moth on the sucrose content of Chinese flowering cabbage

圖6 肽段質量有效性驗證Fig.6 Quality Control Validation of MS Data of Chinese flowering cabbage

2.2.2 菜心葉片蛋白組質譜鑒定結果 應用TMT技術聯合高效液相色譜-質譜 /質譜法技術鑒定到4196個菜心蛋白肽段，經蛋白數據庫搜索，2672個被定量，篩選得到差異表達蛋白430個(接蟲后相比對照上調1.2倍以上的蛋白211個，下調0.83倍以下的蛋白119個)。

2.2.3 差異蛋白組GO分析 上調差異蛋白組GO分析：根據UniProt-GOA (www.http://www.ebi.ac.uk/GOA/)數據庫對差異蛋白質進行GO(gene ontology)分析，按照功能進行分類，上調蛋白中43 %參與了代謝過程，22 %參與了細胞成分組成，22 %參與了單個有機體生命過程，5 %涉及刺激反應，4 %涉及細胞定位，4 %參與其他反應過程。

下調差異蛋白組GO分析：根據UniProt-GOA (www.http://www.ebi.ac.uk/GOA/)數據庫對下調差異蛋白質進行GO(gene ontology)分析，按照功能進行分類，上調蛋白中39 %參與了代謝反應，28 %參與了細胞成分組成，23 %參與了單個有機體生命過程，3 %涉及刺激反應，4 %涉及細胞定位，3 %參與其他反應過程。

2.2.4 差異蛋白分析 這些小菜蛾取食菜心的差異蛋白主要參與生物脅迫、糖代謝、蛋白質與氨基酸代謝、光合作用和呼吸作用的能量及物質的轉化等生物過程。

圖7 菜心上調差異蛋白功能分類Fig.7 Functional classification of up-regulated proteins

與脅迫相關的許多蛋白如蛋白酶抑制劑、谷胱甘肽過氧化物酶、類CASP蛋白、PR4型蛋白、丙二烯氧合酶、幾丁質酶、蛋白酶抑制劑、脂肪氧合酶等在小菜蛾取食菜心后上調表達1.5倍以上，這些蛋白的上調表達有助于菜心啟動小菜蛾危害的防御和耐受機制。

而在小菜蛾取食菜心的糖代謝中，β-1,3-葡聚糖酶、糖基轉移酶、堿性α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶分別上調表達5.675、1.652、2.177、1.779和1.737倍，而甘露糖-3,5異構酶、依賴焦磷酸的磷酸果糖激酶、果糖-二磷酸醛縮酶、甘露糖-6-磷酸異構酶等蛋白分別下調為對照的0.786、0.648、0.776和0.664倍。

在蛋白質與氨基酸代謝中，一些編碼的蛋白質合成蛋白60 s核糖體蛋白、50 s核糖體蛋白等分別上調表達1.785 、2.353 倍，天冬氨酸轉氨酶、天冬酰胺合成酶、半胱氨酸肽鏈內切酶等與氨基酸合成與分解相關的酶類也都上調表達1.5 倍以上，而脯氨酸順反異構酶、絲氨酸羥甲基轉移酶則分別下調為對照的0.790、0.755倍。

圖8 菜心下調差異蛋白功能分類Fig.8 Functional classification of down-regulated proteins

與光合作用等合成代謝相關的許多蛋白下調表達，如光系統l中心反應蛋白、NADP 6-磷酸脫氫酶、葉綠素酯還原酶、鐵氧化還原蛋白、轉運蛋白、葉綠素Mg-螯合酶亞基蛋白、捕光葉綠素a/b結合蛋白分別下調為對照的0.571、0.740、0.504倍和0.575、0.588和0.490倍；另一方面，與能量和呼吸代謝相關的酶：電子傳遞黃素蛋白脫氫酶、質子梯度調控蛋白、細胞色素c、ATP合成酶在小菜蛾取食菜心后上調表達1.5倍以上。

綜上所述，小菜蛾取食菜心24 h后，與逆境脅迫、糖水解及能量代謝相關的一些蛋白上調表達，與光合作用等合成代謝相關的許多蛋白下調表達，說明菜心受小菜蛾取食后其光合作用下降，一些碳水化合物降解釋放能量以維持菜心被取食后的各種生化反應，同時消耗更多能量和上調各種脅迫相關蛋白來應對小菜蛾的取食。

3 討 論

本研應用TMT技術鑒定出4196個菜心蛋白肽段，篩選得到小菜蛾取食菜心前后的差異表達蛋白430個，有效地篩選出小菜蛾取食菜心前后在調控菜心的防御和耐受反應過程中發揮重要作用的差異表達蛋白，并對差異蛋白質組進行了系列生物信息學和功能分析，為進一步的研究積累了大量的基礎數據。此方法獲得的差異蛋白質數目遠大于劉琳琳等應用蛋白質雙向電泳技術鑒定的差異蛋白數(51個)[13]，但由于該方法試劑昂貴，設計實驗處理較少，能確定的關鍵的差異蛋白較為有限，要獲得多更關鍵的差異蛋白，后續研究可設計小菜蛾取食不同菜心品種或不同取食時間的差異蛋白組變化和更多的生理生化實驗以驗證本實驗結果。

表1 部分上調差異蛋白質信息Table 1 A few up-regulated expressed proteins

表2 部分下調差異蛋白質信息Table 2 A few down-regulated expressed proteins

小菜蛾取食菜心前后，差異蛋白組的變化也引起了菜心防御小菜蛾取食的一系列生理變化如葉片可溶性蛋白、可溶性糖含量的升高，可溶性淀粉的下降，這也反映了菜心受小菜蛾取食后需要啟動各種防御反應來保護機體，將平時用于生長和發育的碳源和氮源轉用于防御，而這些反應的過程需要消耗額外的能量來應對昆蟲的取食因此眾多抗性脅迫相關蛋白上調表達。

近年來研究表明，雖然不同的逆境脅迫下會導致大量蛋白表達發生變化，但也存在一些共性的地方：①植物被昆蟲取食后植物體內與逆境脅迫相關的蛋白包括病程相關蛋白、蛋白酶抑制劑、多酚氧化酶、過氧化物酶、脂氧合酶和苯丙氨酸解氨酶等多種蛋白顯著變化[14-17]，與本研究結果相似：小菜蛾取食菜心后菜心葉片類CASP蛋白活性上調3.866倍，PR4型蛋白上調2.878倍，丙二烯氧合酶較對照也上調表達2.503倍，脂氧合酶上調1.603倍，蛋白酶抑制上調1.558倍，這說明這些蛋白在生物脅迫條件下其蛋白組發生了巨大的功能重組，在昆蟲取食誘導的植物防御中具有重要作用；這些與脅迫和生物刺激相關蛋白質的上調表達激活了菜心的防御和耐受反應，也導致小菜蛾取食菜心后其可溶性蛋白的升高；②一些糖代謝相關酶，如β-1,3-葡聚糖酶堿性、α-半乳糖苷酶、糖基轉移酶等糖苷酶發生顯著變化，這與馬歌麗、劉琳琳等前人的研究發現一致：糖苷水解酶是昆蟲體內重要的酶，其量和質的變化是昆蟲適應逆境重要原因之一[13,18]，因此可以推測這些糖苷酶在昆蟲取食誘導的植物防御中發揮重要的作用，糖水解及能量代謝相關的一些蛋白上調表達也有可能是導致小菜蛾取食菜心后還原糖顯著增加的原因之一；③與光合作用等合成代謝相關的許多蛋白下調表達，與能量和呼吸代謝相關的酶上調表達，其主要關聯的一些差異蛋白如檸檬酸合成酶、丙酮酸激酶等參與三羧酸循環糖酵解途徑及抗性脅迫相關途徑，在植物適應逆境中起到了其它物質無法代替的關鍵作用[19-21]。

因此，TMT標記聯合高效液相色譜-質譜 /質譜法(LC-MS/MS)技術加快了功能基因和蛋白的發現步伐，使得人們能從整體水平上對菜心應答小菜蛾取食防御和耐受機制進行有益的探索研究，為深入研究菜心對小菜蛾取食的防御和耐受應答分子調控機制提供理論依據。

4 結 論

本研究結果表明，小菜蛾取食菜心后的差異蛋白主要參與生物脅迫、糖代謝、光合作用和呼吸作用的能量及物質的轉化等生物過程，采用TMT技術，能有效地篩選出小菜蛾取食菜心前后的差異表達蛋白。

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ChangesofCarbohydrateMetabolismandExpressionofProteinsinChineseFloweringCabbageFedbyDiamondbackMoth(Plutellaxylostella)

LUO Hai-ling1,2,3，KANG Hong-wei1， MA Jun4，JU Xi-xi1，ZHANG Li1，SHI Wei-dong1*

(1.Institute of Vegetable,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Guangxi Nanning 530007,China; 2.Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Guangxi Nanning 530007,China; 3.College of Agronomy,Guangxi University,Guangxi Nanning 530004,China; 4.Nanning Municipal Party College of C.P.C,Guangxi Nanning 530007,China)

【Objective】The changes of carbohydrate metabolism and expression of proteins were analyzed to provide the basic theory information for exploring the interactions between the diamondback moth feeding and defense response of Chinese flowering cabbage.【Method】After 24 h the diamondback moth feeding on ‘Sijiu’ Chinese flowering cabbage,the study analyzed rules for soluble starch,soluble protein,sugar and reducing sugar,meanwhile,analyzed expression of proteins by Tandem mass tag (TMT) coupled to two-dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry (2D LC-MS/MS).【Result】The soluble starch accumulation decreased,and soluble protein and soluble sugar (including sugar,reducing sugar) content increased.430 discrepant proteins were detected by bioinformatics analysis using the SEQUEST search engine,211 proteins were up-regulated with a more than 1.2 folds change,and 119 proteins were down-regulated with a less than 0.83 folds.Among them,the ones of photosynthesis were down regulated,while the others related to stress response,some of hydrolytic enzymes and energy metabolism were up regulated.【Conclusion】The TMT was a powerful method for isolating and identifying differentially expressed proteins between the diamondback moth feeding and defense response of Chinese flowering cabbage.Most of them were involved in stress resistance,glycometabolism,photosynthesis,respiration,energy and substance metabolism .

Chinese flowering cabbage; Diamondback moth; Carbohydrate; TMT; Discrepant proteins

1001-4829(2017)4-0773-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.011

2016-12-15

國家自然科學基金項目(31360481)；廣西自然科學基金項目(2014GXNSFBA118122)；廣西農業科學院基本科研業務專項(桂農科2013YQ06，2015YM26)

羅海玲(1980-)，女，廣西全州人，碩士，助理研究員，主要從事作物生理與分子生物學研究工作，E-mail：luohailing@gxaas.net，*為通訊作者，史衛東，E-mail：shiwd@gxaas.net。

S436.341.2+4

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(責任編輯 王冠玉)