改良Lowry法測定不同產地凹紋胡蜂藥材蛋白質含量

* 傳坤

1.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000； 2.中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，云南 大理 671000； 3.藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南 大理 671000； 4.上海華匯拓醫藥科技有限公司，上海 201203；5.云南民族大學，云南 昆明 650504

改良Lowry法測定不同產地凹紋胡蜂藥材蛋白質含量

楊志斌1,2,3翟寶祺2,4楊紅1,2,3劉衡1,2,3李成功1,2,3張艷1,2,3許忻2,4*許傳坤1,3,5*

1.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理 671000； 2.中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，云南 大理 671000； 3.藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南 大理 671000； 4.上海華匯拓醫藥科技有限公司，上海 201203；5.云南民族大學，云南 昆明 650504

目的建立凹紋胡蜂藥材中蛋白質含量測定的方法。方法采用改良Lowry法測定標準小牛血清蛋白(BSA)和凹紋胡蜂藥材中的蛋白質含量并對其進行方法學考察。結果該方法線性及相關度良好，線性范圍較寬，精密度、穩定性、重復性和加樣回收率較佳；用該方法分別對不同產地的3批凹紋胡蜂藥材中蛋白質含量進行測定，蛋白質含量分別為：德宏州(批號：20150630)12.37%，保山市(批號：20150927)13.08%，曲靖市(批號：20151112)9.63%，藥材含水量經測定依次為6.12%、9.92%、10.17%。結論不同產地凹紋胡蜂藥材中蛋白質含量有一定差異，采自曲靖市的樣品蛋白質含量偏低；實驗采用的改良Lowry法測定結果準確、簡便、穩定，適用于凹紋胡蜂藥材中蛋白含量的測定。

凹紋胡蜂；改良Lowry法；蛋白質；含量測定；方法學研究

昆蟲是一種種類繁多、數量龐大、極具開發潛力的自然資源[1]。胡蜂作為重要的昆蟲資源之一，因其幼蟲含有豐富的蛋白質和人體必須的氨基酸[2]，成蟲具有治療風濕性關節炎和心腦血管疾病的活性成分[3-4]，近年來越來越多的學者開始關注胡蜂的開發潛力，對其營養成分及食用價值、常微量元素等進行了研究[5-7]，擬通過規范化的養殖達到胡蜂藥品和食品的開發利用[8]。凹紋胡蜂(VespavelutinaaurariaSmith)是胡蜂科胡蜂屬昆蟲，主要分布于我國云南、廣西、四川、西藏等地區，云南民間常將其蜂巢、蜂毒等入藥，以防治風濕病和關節炎等疾病，蜂蛹則是傣族、景頗族等少數民族的傳統美食[9]。研究表明[10]，蛋白質是胡蜂的主要營養成分及藥效組分，但國內外未見有凹紋胡蜂蛋白質測定的相關報道，因此筆者以云南地區的凹紋胡蜂為研究對象，使用經改良的Lowry法對其進行蛋白質含量的測定，為凹紋胡蜂入藥及藥材質量研究與開發提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 藥材 凹紋胡蜂鮮品采集于云南省德宏傣族景頗族自治州(批號：20150630)；云南省保山市(批號：20150927)；云南省曲靖市(批號：20151112)共三批。樣品經中國科學院昆明動物研究所董大志研究員鑒定為胡蜂科胡蜂屬凹紋胡蜂VespavelutinaaurariaSmith。將鮮品置于-20℃凍死，再經40℃干燥12h即得干品。

1.2 儀器 T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；BSA124S型分析天平(Sartorius，德國賽多利斯)；Exceed-Ca型超純水機(臺灣艾柯)；YUEXIN101AS-2型電熱鼓風干燥箱(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠)。

1.3 試劑 Folin酚試劑(上海如吉生物科技發展有限公司，批號：151104)；標準小牛血清蛋白(BSA，北京索萊寶生物科技有限公司，批號：112012)；其他試劑均為分析純；水為去離子水。

2 實驗方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱定標準小牛血清蛋白20.0mg，置于100mL量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻，即得0.2mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取三批凹紋胡蜂藥材粉末(每批3份)1.0g，置于100mL圓底燒瓶中，精密移取25mL水加入到樣品中，稱定重量，靜置1h后回流提取1h，冷卻至室溫后補足至原重，過濾，取續濾液即為供試品溶液。

2.2 標準曲線的繪制 采用改良Lowry法[11]對標準品溶液進行測定，方法如下：精密吸取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別加水補足至1.0mL，使終濃度為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/mL。再精密加入堿性銅試劑1.0mL，搖勻，于室溫放置10min，再精密移取4.0 mL的Folin酚試劑稀釋液(1→8)依次加入其中并立即混勻后于55℃水浴10min，取出后再冷水浴10min，于650nm波長處測定吸光度值；同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度(mg/mL)與其對應的吸光度值(A)計算線性回歸方程。標準曲線方程、線性范圍及相關系數見表1。

表1 標準曲線方程、線性范圍及相關系數

2.3 精密度試驗 精密吸取1.0mL的對照品溶液(0.2mg/mL)。按照標準曲線項下方法測定吸光度值，連續測定6次。結果表明，對照品吸光度值RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩定性試驗 精密稱取云南省曲靖市(批號：20151112)的凹紋胡蜂藥材適量，依法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液20μL，加水補足至1.0mL，按標準曲線項下方法分別于0、1、2、4、16、24h測定吸光度值。結果表明，供試品溶液吸光度值的RSD為0.31%，表明其在24h內基本穩定。

2.5 重復性試驗 精密稱取云南省曲靖市(批號：20151112)的凹紋胡蜂藥材6份，每份約1.0g，依法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液20μL，加水補足至1.0mL，再按標準曲線項下方法測定吸光度值，并計算含量。結果測得蛋白質含量的平均值為10.06%，RSD為1.46%，表明方法的重復性良好。

2.6 加樣回收試驗 分別取云南省曲靖市(批號：20151112)的凹紋胡蜂藥材6份，每份約0.5g，精密稱定，按表2精密稱定并加入BSA對照品，依法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液20μL，加水補足至1.0mL，再按照標準曲線項下方法測定吸光度值，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.7 樣品的水分測定 按《中國藥典(2015版)》烘干法測定，見文獻[12]。結果如表3所示，測得3批不同產地的凹紋胡蜂藥材含水量平均值為8.74%。其中，德宏州、保山市和曲靖市的藥材含水量分別為6.12%、9.92%和10.17%。

2.8 樣品蛋白質含量的測定 精密吸取供試品溶液20μL，加水補足至1.0mL，再按照標準曲線項下方法測定吸光度值。結果如表3所示，測得3批不同產地的凹紋胡蜂藥材蛋白質含量平均值為11.69%。其中，德宏州、保山市和曲靖市的藥材蛋白質含量分別為12.37%、13.08%和9.63%。計算公式如下。

蛋白含量(%)=

樣品水分/%蛋白質含量/%德宏州(批號：20150630)612±0051237±102保山市(批號：20150927)992±0051308±122曲靖市(批號：20151112)1017±107963±131均值8741169

3 討論

本文所使用經改良的Lowry法與《中國藥典(2015版)》四部中的方法相比，不同點在于原方法加入福林酚試劑混勻后于室溫放置30min后再測定，此過程中顯色的深度隨時間不斷加深，須規定統一的反應時間且等待時間較長。而經改良后變為于55℃水浴5min，取出后冷水浴10min再測定，加快了顯色反應的時間且顏色深度變化較穩定。該方法具有較寬的線性范圍，準確靈敏，穩定性佳，回收率高，重復性好，可作為凹紋胡蜂藥材蛋白質含量測定的方法之一。

對3批凹紋胡蜂藥材蛋白質含量和水分的測定結果表明，不同產地凹紋胡蜂藥材的內在品質還是存在一定的差異，可能與不同地區的氣候條件和飼養環境有關系，值得進一步深入的研究。

因國內尚未有統一的凹紋胡蜂藥材質量標準，本文的研究結果可為將來藥材的質量標準的研究和建立提供參考和依據。

[1]劉輝, 魯為華. 昆蟲資源的開發與利用 [J].飼料與畜牧, 2003(1): 32-33.

[2]王云珍, 董大志, 陸源, 等. 凹紋胡蜂與黑尾胡蜂蛋白氨基酸分析研究 [J].Zoological Research, 1988, 9(2): 140-170.

[3]李春艷. 大胡蜂屬昆蟲的鎮痛抗炎有效部位及其制備方法和用途 [P]. 中國: CN103638065A, 2014-03-19.

[4]巫秀美. 具有抗血栓形成作用的黃胡蜂屬昆蟲中多肽有效部位 [P].中國: CN103638059A, 2014-03-19.

[5]陳玉惠, 歐曉紅. 凹紋胡蜂食用蟲態營養成分分析及其利用價值評價 [J].西南林學院學報, 1997, 17(1): 39-42.

[6]楊紅, 陳丹, 肖培云, 等. 凹紋胡蜂成蟲的重金屬及常量、微量元素分析 [J].廣州化工, 2016, 11(10): 141-143.

[7]馮穎, 陳曉鳴, 葉壽德, 等. 云南常見食用胡蜂種類及其食用價值 [J].林業科學研究, 2001, 14(5): 578-581.

[8]郭云膠, 高鵬飛, 趙昱. 胡蜂科昆蟲資源可持續利用的科學養殖技術 [J].安徽農業科學, 2012, 40(21): 10906-10908.

[9]郭云膠, 高陞, 羅自旺. 人工養殖凹紋胡蜂試驗研究 [J].硅谷, 2013(4): 150-152.

[10]Wang bin, Zhang chenggui, Gao pengfei, et al. Research progress on Nidus vespae, a traditional chinese medicine derived from insects [J].Journal of Pharmaceutical & Scientific Innovation, 2013, 2(6): 1-9.

[11]賀建華, 邵純君, 鹿麟, 等. 福林酚法測定甘露聚糖肽口服溶液中蛋白質的含量 [J].中國藥物評價, 2017,(2): 92-94.

[12]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(四部) [M].北京:中國醫藥科技出版社, 2015: 103-105.

StudyonAnImprovedLowryMethodforDetectingtheContentofProteininVespavelutinaaurariaSmith

YAHG Zhibin1,2,3ZHAI Baoqi2,4YANG Hong1,2,3LIU Heng1,2,3LI Chenggong1,2,3ZHANG Yan1,2,3XU Xin2,4*XU Chuankun1,3,5*

1. Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali University, Dali 671000, China; 2. Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali University, Dali 671000, China; 3. The National-local Joint Engineering Laboratory for Entomoceutics, Dali 671000, China; 4. Shanghai Synergy Pharmaceutical Sciences Co.,LTD, Shanghai 201203, China; 5. Yunnan Minzu University, Kunming 650504, China

ObjectiveTo establish a method for the content determination of protein inVespavelutinaaurariaSmith.MethodsThe concentrations of bovine serum albumin ( BSA ) andV.velutinaaurariawasdetermined by the modified Lowry method, and to carry out methodological study.ResultsThis method had good correlation linearity, wide linear range and good precision, stability, repeatability and recoveries.ConclusionThe modified Lowry method to determine the protein concentration ofV.velutinaaurariais accurate, simple and stability, it's suitable for protein content determination ofV.velutinaauraria.

VespavelutinaaurariaSmith；Modified Lowry Method；Proteins；Content Determination；Methodology

R29

A

1007-8517(2017)18-0026-03

2017-08-20 編輯：穆麗華)

國家自然科學基金(81660605；81260676)；藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心創新能力建設項目(云發改高技[2015]395)；云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室專項經費(2015DG030)；云南省2011協同創新中心項目([2012]25)；云南省應用基礎研究重點項目(2014FA007)。

楊志斌(1986-)，男，白族，碩士研究生，研究實習員，研究方向為昆蟲藥物質基礎及藥效。E-mail:79204431@163.com

許傳坤(1977-)，男，漢族，博士研究生，高級工程師，研究方向為天然藥物研究與開發。E-mail：chkxu@163.com

許忻(1974-),男，漢族，博士研究生，高級工程師，研究方向為藥效物質基礎。E-mail:xuxin@huahaipharm.com