鳳尾草中黃酮提取物對小鼠光老化損傷皮膚的修復作用

陳家明+張美琴+陳寧

[摘要] 目的 探討鳳尾草中黃酮提取物對因紫外線照射所致小鼠皮膚光老化的具體修復作用，為該植物的藥用提供理論基礎。 方法 選取經(jīng)過紫外線照射所致光老化的40只損傷模型小鼠，按照性別匹配分為A組（不做處理）、B組（生理鹽水涂抹）、C組（生理鹽水+維生素C）、D組（生理鹽水+黃酮蘆丁提取物），每組10只。隨訪觀察10 d，比較四組小鼠皮膚粗糙度（SER）、表面鱗屑（SESC）、皺紋評估（SEW）、愈合面積百分比、微血管密度（MVD）、皮膚愈合時間、結痂時間、絨毛生成時間的差異。 結果 第7天和第10天，A、B、C組SER、SESC、SEW均顯著高于D組（均P < 0.05），愈合面積百分比、組織MVD均顯著低于D組（均P < 0.05）。A、B、C組小鼠皮膚愈合時間、皮膚結痂時間、絨毛生成時間均顯著短于D組（均P < 0.05），且A組小鼠的各項指標測定結果最大，而D組小鼠的各項指標測定結果最小；皮膚組織病理學檢查結果顯示，A組小鼠皮膚膠原纖維呈現(xiàn)出無規(guī)則斷裂狀，B組小鼠皮膚真皮層的空洞進行性擴大，C組小鼠皮膚的表皮相對完整，D組小鼠皮膚的表皮恢復情況較好，膠原纖維量也高于其他組別。 結論 生物類黃酮蘆丁物質有助于皮膚光老化損傷的修復，表現(xiàn)在皮膚外觀性狀和內部組織結構上，其療效優(yōu)于維生素C，能顯著提升皮膚愈合時間。

[關鍵詞] 鳳尾草；生物類黃酮；光老化；皮膚損傷；修復

[中圖分類號] R758.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（a）-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the specific repairing effects of flavonoids extract from Pteris multifida Poir on photoaged skin of mice caused by ultraviolet irradiation， and to provide a theoretical basis for the medicinal use of this plant. Methods Forty damaged model mice with photoaging caused by ultraviolet irradiation were selected， according to the gender， they were divided into group A （no treatment）， group B （smeared normal saline）， group C （smeared normal saline + vitamin C）， group D （smeared normal saline + flavonoids rutin extract）， with 10 mice in each group. Follow-up observation of 10 days， the differences of surface evaluation of roughness （SER）， surface evaluation of scales （SESC）， surface evaluation of wrinkles （SEW）， percentage of healed area， microvessel density （MVD）， skin healing time， scab time and fluff generated time among the four groups were compared. Results In the 7th and 10th days， the SER， SESC， and SEW in group A， B， and C were all significantly higher than those of group D （all P < 0.05）， the percentage of healed area and MVD were significantly lower than those of group D （all P < 0.05）. The skin healing time， scab time and fluff generated time in group A， B， C were significantly shorter than those of group D （all P < 0.05）， and the results of each index in group A were maximum， and the results of each index in group D were minimum. Skin histopathologic examination showed that， the skin collagen fibre in group A showed no regular fracture， the emptiness of the dermis in group B was enlarged gradually， the epidermis of group C was relatively intact， the epidermis of group D had better recovery conditions and collagen fibers were also more than other groups. Conclusion Biological flavonoids rutin substances contribute to the repair of photoaged skin， reflected in the skin appearance and internal organizational structure， the efficacy is better than vitamin C， which can greatly enhance the skin healing time.endprint

[Key words] Pteris multifida Poir； Bioflavonoids； Photoaging； Skin damage； Repair

隨著居民生活、物質水平的提高，人們對皮膚的護理有了更高的追求，但是環(huán)境的污染和人們的一些不良癖好并沒有得到很有效的控制，人們皮膚損傷的問題逐漸加重[1]。隨著對皮膚損傷研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)廣泛存在于植物界中的黃酮類化合物，具有清除皮膚中自由基、促進皮膚新陳代謝、減少色素沉著、潤澤肌膚等作用[2]。鳳尾草性寒、微苦，歸大腸、胃經(jīng)，是一種民間廣泛使用、歷史悠久的中草藥。研究表明，該類植物中富含生物類黃酮，而黃酮可以經(jīng)局部透皮吸收的方式作用于皮膚，對光損傷導致的皮膚損害有較好的效果[3]。本研究通過黃酮涂抹紫外線照射所致?lián)p傷的皮膚，分析皮膚愈合情況，以驗證該物質的臨床實用效果，現(xiàn)將結果匯報如下：

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取健康、潔凈的SPF級昆明種小鼠40只，2月齡。雌雄各半，體重20～25 g，平均（22.15±2.08）g，去毛成裸鼠（由長沙醫(yī)學院動物實驗中心提供，編號為43006700009824），按照性別匹配將小鼠分為四組，每組10只。

1.2 方法

1.2.1 光老化所致皮膚損傷小鼠的造模 所有小鼠在波長為280～320 nm的UVB燈管下模擬紫外線長期照射，照射期間照常喂食，直至可以明顯觀察到裸鼠皮膚出現(xiàn)皺紋[4]。

1.2.2 儀器與試劑 均由長沙醫(yī)學院機能實驗室提供。儀器：精密分析天平（Sartorius公司，德國）；TGF-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器（江蘇金壇城國勝實驗儀器廠）；DHG-907A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）等。試劑：鳳尾草（安徽亳州滬譙飲片廠，批號20150628）；蘆丁標準品（上海嘉偉化學試劑有限公司，批號130198）等，所有試劑均為分析純級別。

1.2.3 鳳尾草中總黃酮的提取和純化 稱取鳳尾草樣品10 g，打碎機制成粉末，放置于10個100 mL錐形瓶中，使用60%濃度的甲醇按10 mL/g的比例混勻，然后置于超聲波輔助下進行提取3次，每次10 min，提取液以3500 r/min的速度離心10 min，然后進行抽濾、除渣、純化后得到生物類黃酮提取物[5]，最后提取得來的總黃酮含量。

1.2.4 黃酮含量的測定 參照周國梁等[6]《鳳尾草總黃酮超聲波提取工藝研究》的方法，取蘆丁標準品溶液，以質量濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標制備標準曲線，然后將所制取的鳳尾草總黃酮樣品按相同步驟配置溶液，在一樣的實驗操作條件下測量提取液A值，再按計算提取率（%）=樣品溶液中的總黃酮量/樣品重×100%的公式確定含量。

1.2.5 藥物劑量的配置 本研究提取的鳳尾草含量為1.7255 mg/g，而Vit C則使用禾博士牌維生素C咀嚼片，每片1 g含有100 mg Vit C。按照鳳尾草提取物5 mg/mL配置溶液，而Vit C則按照50 mg/mL配置，配置中均使用雙蒸水進行調配，和生理鹽水的體積配比則為1∶1。

1.2.6 分組及處理 A組：完全空白對照，小鼠皮膚不做任何處理。B組：用生理鹽水均勻涂抹皮膚，每2小時1次。C組：用生理鹽水和維生素C配置的溶液進行涂抹治療，每2小時1次。D組：用生理鹽水和黃酮蘆丁提取物配置的溶液進行涂抹治療，每2小時1次。

1.3 觀察指標

于治療第0、3、7天和10天，分別對小鼠如下指標數(shù)據(jù)進行采集，常規(guī)指標：皮膚粗糙度（SER，使用活性皮膚表面分析系統(tǒng)計算得出）；表面鱗屑（SESC，計算亮象素的比例得出）；皺紋評估（SEW，皺紋深度的比例）；愈合面積百分比（采用Adobe Image Ready 7.0測得，使用愈合面積/初始創(chuàng)面面積公式計算）；微血管密度（MVD，采用Pareek方法測得）[7]。觀察皮膚愈合時間、結痂時間、絨毛生成時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）進行描述，多組計量資料比較使用F檢驗，兩組計量資料比較使用t檢驗。重復測量計量資料采用重復測量方差分析，若差異有統(tǒng)計學意義，則使用SNK-q檢驗對多個樣本均數(shù)進行全面的兩兩比較。計數(shù)資料使用構成比進行描述，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠皮膚恢復情況常規(guī)指標的比較

四組小鼠皮膚恢復情況進行重復測量方差分析發(fā)現(xiàn)，各指標的差異均由組間處理因素和時間因素構成，而組間和時間不存在交互作用。經(jīng)方差分析，第3天，四組小鼠SER、SESC、SEW比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P > 0.05），愈合面積百分比、組織MVD比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05），且A、B、C組均顯著低于D組（均P < 0.05）。第7天和第10天，四組SER、SESC、SEW、愈合面積百分比、組織MVD比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05），且A、B、C組SER、SESC、SEW均顯著高于D組（均P < 0.05），愈合面積百分比、組織MVD均顯著低于D組（均P < 0.05）。見表1。

2.2 四組小鼠恢復情況具體愈合時間的比較

四組小鼠皮膚愈合時間、皮膚結痂時間、絨毛生成時間比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05），且A、B、C組均顯著低于D組（均P < 0.05），A組小鼠的各項指標測定結果最大，而D組小鼠的各項指標測定結果最小。兩兩比較分析其差異的具體來源，皮膚愈合指標上，A組和C組、A組和D組、B組和C組、B組和D組、C組和D組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）；皮膚結痂和絨毛生成指標上，A組和B組、A組和C組、A組和D組、B組和C組、B組和D組、C組和D組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。見表2。endprint

2.3 組織病理學研究

A組能夠清晰看出小鼠皮膚表皮細胞大多脫落，細胞發(fā)生變性壞死，在結構中能明顯看出縱向裂痕，真皮層看到許多空洞狀，膠原纖維呈現(xiàn)出無規(guī)則斷裂狀。B組小鼠皮膚表皮呈現(xiàn)較多壞死區(qū)域，真皮層的空洞進行性擴大，裂縫清晰明顯，膠原蛋白無規(guī)則排序。C組小鼠表皮相對來說較為完整，皮膚結構清晰，但是真皮中的膠原纖維蛋白仍有一定斷裂，可見少量空洞。D組小鼠表皮恢復情況較好，結構清晰，細胞形態(tài)完整，膠原細胞少見空洞、排列緊密，膠原纖維量也高于其他組別。見圖1。

3 討論

人體皮膚衰老過程中除自然老化因素外，外源性刺激物的影響也至關重要，而外源性老化的主要原因有紫外線輻射、吸煙等[8]，其共同機制為影響機體的抗氧化功能，以及氧自由基的異常增多從而加速皮膚的老化[9]。隨著人類生存自然環(huán)境的惡化，因紫外線過度輻射導致皮膚光老化的現(xiàn)象日益突出。光老化的皮膚傷口在愈合過程中需要經(jīng)過炎癥、增殖和重塑共3個階段，合理臨床用藥以有效調控皮膚炎癥和抗氧化過程，是促進皮膚快速、完整愈合的重要渠道[10]。

紫外線（UV）照射皮膚后，盡管大部分會被表皮吸收，影響角質形成細胞，但仍有一部分會深入真皮上部，慢性的UVB輻射會隨著時間長期的變化而在體內造成累積的傷害，通過產(chǎn)生氧自由基進而引發(fā)一系列氧化性損傷，導致皮膚色素改變，DNA氧化破壞，使皮膚發(fā)生免疫抑制反應[11-13]。而大量研究也證明，UVB輻射導致皮膚出現(xiàn)衰老的最關鍵的外界因素之一，除此之外，配體蛋白p66Shc在機體的線粒體功能、氧化應激機制中都扮演著較為重要的角色，能夠促進線粒體內ROS的大量產(chǎn)生[14-15]。眾所周知，人體內自由基數(shù)量的增多會破壞細胞正常結構，引起脂質過氧化，干擾人體皮膚的正常代謝活動，加速人體皮膚的老化。有文獻表明，p66Shc蛋白分子可以抑制細胞內線粒體的氧化應激反應來實現(xiàn)其抗光損傷的功能[16-18]。本研究結果顯示，使用鳳尾草中黃酮提取物治療，小鼠光老化皮膚的SER、SESC、SEW情況均顯著好于其他組別小鼠。原因在于生物類黃酮能快速催化和消除超氧陰離子，有效抑制自由基對脂質和蛋白質的破壞，從而加快皮膚深層次組織和表觀癥狀的恢復[12-13]。

鳳尾草總黃酮能夠通過提高皮膚組織SOD的酶活性有效地減少由紫外照射誘導的ROS的產(chǎn)生，還可以減少機體中遭受其損害的脂質過氧化物發(fā)生過氧化反應所產(chǎn)生的MDA，這些自由基含量的下降能夠穩(wěn)定羥基化酶的活性[14，17]。也有研究表明，總黃酮可以清除ROS保護細胞，提升皮膚清除過氧化物的能力，也可以有效維持機體自由基產(chǎn)生與清除的平衡，并增加皮膚中Ⅰ型膠原蛋白含量，阻礙皮膚組織纖維化的過程[15，18]，而且生物類黃酮會利用它本身的強氧化性阻止氧自由基的引發(fā)和氧化反應的進行，通過加快被損傷皮膚組織的重建，加速皮膚結痂、絨毛生成等愈合過程，消除炎癥、分解毒物。生物類黃酮與維生素C配合使用被驗證該治療方式的安全性和穩(wěn)定性是非常可靠的。

綜上所述，生物類黃酮不僅可以有效地修復受損的皮膚，還能抗氧化，對修復皮膚紋理、減少皮膚皺紋以及色素都有較好的功效[19]。盡管有著各種各樣的不利因素影響著人們的皮膚，但是隨著人們對生物類黃酮研究的逐漸深入，相信皮膚損傷的問題會逐漸得到改善。

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（收稿日期：2017-05-02 本文編輯：張瑜杰）endprint