象草基因的克隆及生物信息學分析

吳娟子　錢晨　張建麗

摘要：從象草中克隆了基因，并對其進行了初步的生物信息學分析。利用轉錄組測序獲得的表達序列信息，設計1對特異性的PCR引物，應用RT-PCR技術從象草中擴增出CpCCoAOMT2基因。對獲得的基因進行序列同源性搜索、結構域搜索及3D結構預測、分子系統進化樹構建等生物信息學分析。測序結果表明，CCoAOMT2基因全長926 bp，含110 bp的5′-UTR、741 bp的CDS和75 bp的3′-UTR，共編碼246個氨基酸，GenBank登錄號為BankIt1975804；Blastn和BlastT分析結果顯示，[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]基因及其編碼的蛋白在核苷酸水平和氨基酸水平上與多種植物的CCoAOMT基因和CCoAOMT蛋白具同源性；預測CpCCoAOMT2蛋白相對分子質量為27 253，等電點為508，是一個不含跨膜結構域、不含信號肽分子的親水性、穩定蛋白。分子進化樹分析結果表明，CpCCoAOMT2蛋白與禾本科植物的CCoAOMT蛋白親緣關系最近，與裸子植物和蕨類植物關系較近，而與雙子葉植物的關系較遠。

關鍵詞：象草；咖啡酰酸輔酶A-O-甲基轉移酶；基因克隆；生物信息學分析

中圖分類號： Q785文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0033-04

收稿日期：2016-12-14

基金項目：國家自然科學基金（編號：31302025）；江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（14）5035]；國家牧草產業技術體系鹽城綜合試驗站項目（編號：CARS-35）；浙江省寧波市科技計劃（編號：2016C10018）。

作者簡介：吳娟子（1977—），女，湖北京山人，博士，副研究員，主要從事牧草育種和產業化關鍵技術研究。E-mail：jzwu2014@jaasaccn。

象草（Cenchrus purpureus Schum）是一種多年生禾本科C4植物，具有高生物量，高光合效率、多用途、不占用耕地的優點。它是世界上生物量最高的草本，年生物量可達45 t/hm2。它可作為草食畜禽的優質青飼料，理想的水土保持作物，高質量人造板、紙漿和木質纖維素類能源的優質原料[1-7]。大量研究表明，植物細胞壁組成和特征對木質纖維素類的高效利用具有重要意義，例如，提高其細胞壁的纖維素含量，降低其木質素含量，可以改善其飼料品質和木質纖維素轉化利用效率[8-10]；提高其木質素含量，有利于其作為板材的性能。因此，木質素是限制細胞壁降解利用的關鍵因素之一，如何合理改變象草木質素組成和含量對于有效利用象草具有重要意義。

木質素是一種復雜的酚類聚合物，木質素單體合成是木質素合成的關鍵環節，研究表明，主要有10種酶參與了木質素單體的合成。目前，國內外通過改變這10種酶基因的表達，調控植物木質素含量與組分的研究進展迅速，已相繼從多種不同的植物中分離克隆了多個木質素生物合成代謝中的關鍵酶基因[10-11]。咖啡酰輔酶A甲基轉移酶（caffeoyl CoA O-methyltransferase，CCoAOMT）是植物木質素生物合成過程中一類重要的甲基轉移酶，催化咖啡酰CoA甲基化為阿魏酰CoA[12-14]。國內外的研究表明，抑制楊樹和輻射松[14]等植物的CCoAOMT基因表達，植物木質素含量下降，同時伴隨S/G比值增大，木質素結構變得疏松，易于去除，且不影響植物的正常生長。迄今為止，已經從玉米、小麥、大麥、水稻、綠竹、南荻和柳枝稷等禾本科植物中克隆了CCoAOMT基因。NCBI中已有一個象草CCoAOMT基因（核酸登錄號：KJ9957361）的記錄，但未見其他研究和相關報道。本研究從象草中分離克隆了另1個CCoAOMT基因，命名為[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]，并對其進行了生物信息學分析，以期為研究象草CCoAOMT基因及其編碼蛋白在象草木質素代謝中的功能提供理論依據，為象草的木質素改良提供基礎。

1材料和方法

11試驗材料

象草品系為eg7，種植于江蘇省農業科學院試驗田，在自然條件下生長，待植株生長5個月后取植株中部的莖段，迅速置于液氮中，帶回實驗室-80 ℃保存備用。

12試驗方法

121引物設計

基于筆者所在課題組完成的象草轉錄組測序數據，利用Primer50軟件設計1對特異性PCR擴增引物F：5′-GAGTAGTGGGCGACCTGTGA-3′和R：5′-GAAGGGGAAGGAAAACTTATTG-3′，引物序列由通用生物公司合成。

122象草總RNA的提取、純化及cDNA的合成

采用TRIzol（Invitrogen）試劑提取象草莖總RNA，用RNase-free DNase Ⅰ（Fermentas）除去象草總RNA樣品中的DNA污染，12% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA純化效果，NanoDrop2000檢測濃度。參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）說明書進行cDNA的合成。

123象草基因的RT-PCR擴增

25 μL PCR反應體系為：10×LA PCR Buffer 25 μL，MgCl2 25 μL，dNTP Mixture 4 μL，正、反向引物各05 μL，LA Taq DNA酶025 μL，ddH2O 1325 μL，模板cDNA 15 μL。PCR反應使用降落PCR，PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火（1～2循環70 ℃，3～4循環69 ℃，5～6循環68 ℃，7～8循環67 ℃，9～10循環66 ℃，11～12循環65 ℃，13～14循環64 ℃，15～16循環63 ℃，17～18循環62 ℃，19～20循環 61 ℃，21～22循環60 ℃，23～24循環59 ℃，25～26循環 58 ℃，27～28循環57 ℃，29～30循環56 ℃）每個循環40 s，72 ℃ 90 s；72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。采用凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，擴增產物經PCR驗證與目標條帶一致后送通用生物公司測序。[JP]endprint

124合成序列拼接、比對和生物信息學分析

所得的序列用Sequencher 48進行拼接并根據峰圖進行手工校正。測序完成后，3次測序結果中的2次共同核苷酸合并為基因片段最終序列。利用DNAMAN V6和BioXM26軟件進行序列比對和氨基酸序列的推導，并通過NCBI的BLAST工具與GenBank中的已知序列比較，進行蛋白序列的相似性分析。利用ProtParam軟件在線分析蛋白質的分子結構和理化性質；采用TMHMM在線分析軟件預測蛋白質的跨膜結構域；通過SignalIP分析軟件對信號肽進行預測；蛋白質的二級結構和三級結構預測分別使用在線分析軟件NPSA和SWISS-MODEL完成。利用MEGA606軟件對氨基酸序列進行系統進化樹分析。

2結果與分析

21象草莖基因全長cDNA克隆

以象草莖中RNA為模板，利用F/R引物進行RT-PCR擴增，獲得了預期大小的cDNA片段（圖1）。將目的片段進行回收、純化、驗證并測序，獲得的CpCCoAOMT2基因全長為926 bp，含110 bp的5′-UTR、75 bp的3′-UTR和1個 741 bp（111～851 bp）的開放閱讀框，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，G+C含量為649%，共編碼246個氨基酸，GenBank登錄號為BankIt1975804。

22象草CpCCoAOMT2蛋白的生物信息學分析

用在線網站（http：//webExpasyorg/protparam）預測編碼蛋白質的分子式為C1 212H1 926N328O365S10，總原子數為3 841個，相對分子質量為27 253。Leu、Ala和Asp在氨基酸組成中出現頻率較高，分別占總氨基酸的122%、102%和93%，而Trp、Cys和His出現的頻率較低，僅占 08%、12%和24%；理論pI為508，其中帶正電荷（Arg+Lys）和負電荷（Asp+Glu）殘基總數分別為27個和37個；不穩定系數為2605，是不穩定蛋白；脂肪族系數為9793；親水性平均系數為-0100，屬親水性蛋白；半衰期為30 h。

TMHMM軟件（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）預測CpCCoAOMT2蛋白不存在跨膜結構域。采用分析軟件SignalIP（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/）對獲得的CpCCoAOMT2氨基酸序列的信號肽序列進行預測，預測其沒有信號肽序列。通過NPS（https：//npsa-prabiibcpfr/cgi-bin/secpred_hnnpl）預測CpCCoAOMT2氨基酸序列的二級結構，發現其多肽鏈中主要結構元件是α螺旋和無規則卷曲，分別占4797%和3862%，延伸鏈占1341%；運用SWISSMODEL工具（https：//swissmodelexpasyorg）對CpCCoAOMT2的氨基酸序列進行同源三維建模（圖2），模型以Automated mode方式構建，建模范圍是從第19個到第245個氨基酸，其建模參考模板為高粱（Sorghum bicolor）咖啡酰輔酶A甲基轉移酶（登陸號：5kva1A），目標蛋白與參考蛋白的序列比對一致性為6344%。

23象草[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]基因推導酶蛋白氨基酸序列比較與分子進化分析

在Pfam（http：//pfamxfamorg）和NCBI上對獲得的[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列進行保守結構域分析，發現CpCCoAOMT2具有Methyltransf_3（O-methyltransferase，PfamPF01596）和AdoMet_MTases（S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases，cd02440）保守區，是一種甲基轉移酶（圖3）。將[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列與柳枝稷（Panicum virgatum，BAO208821）、玉米（Zea mays，NP_0011525111）和水稻（Oryza sativa，BAG925181）編碼的CCoAOMT氨基酸序列進行多重比對分析，其與柳枝稷和玉米的CCoAOMT酶蛋白序列同源性高達93%、90%，具有高度的保守性，且具有植物甲基酶所共有的A、B、C保守序列元件和CCoAOMT基因家族中所特有的標簽序列D、E、F、G、H等5個保守序列元件[15]（圖4）。

象草[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]基因推導的酶蛋白氨基酸序列與其他植物已報道的相應序列進行多序列比較，并構建系統樹（圖5）。結果顯示，象草CpCCoAOMT2酶蛋白氨基酸序列與禾本科的柳枝稷（Panicum virgatum：BAO208821）、玉米（Zea mays：NP_0011525111）的同源性相對較高；與禾本科的水稻（Oryza sativa：BAG925181、BAG984141）、小麥（Triticum aestivum：BAD063211）的同源性次之；象草CpCCoAOMT2酶蛋白氨基酸序列與NCBI中已有記錄的象草CpCCoAOMT（Cenchrus purpureus：AIN395351）的同源性相對較低；而CpCCoAOMT與禾本科中的美洲狼尾草（Cenchrus americanus：ALL436671）、 柳枝稷（Panicum virgatum：BAO208811） 和芒草（Miscanthus lutarioriparius：AEJ830601）的同源性相對較高。

在系統進化樹分析中可見，本研究所克隆的象草[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]基因與禾本科植物的同類基因親緣關系最近，與裸子植物（臺灣杉，Taiwania cryptomerioides；臺灣扁柏，Chamaecyparis formosensis）和蕨類植物（江南卷柏，Selaginella moellendorffii）關系較近，而與雙子葉植物關系的較遠（擬南芥，Arabidopsis thaliana；油菜Brassica napus；亞麻Camelina sativa）（圖5、表1），本結論與李雪平等在禾本科植物綠竹和南荻中的研究結果[16-17]類似，也符合象草分類學中的地位。endprint

3討論

本研究從象草品系eg7中克隆了1個[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]全長基因，[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列保守結構域分析發現，其具有Methyltransf_3和AdoMet_MTases保守結構域，是一種甲基轉移酶。對[WTBX][STBX]CpCCoAOMT2[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列進行多重比對發現，CpCCoAOMT2不僅包含了植物甲基轉移酶中普遍存在的A、B和C 3個保守序列元件，還包含CCoAOMT基因家族中所特有的標簽序列，即D、E、F、G和H 5個保守序列元件[CM（25]，說明該基因具有CCoAOMT類基因所有的標志性特征元

件[15]，因此推測CpCCoAOMT2是CCoAOMT基因家族的一個成員，但其具體功能還有待于進一步研究。在系統發育樹分析中，CpCCoAOMT2基因與禾本科植物的同類基因親緣關系最近，與裸子植物和蕨類植物關系較近，而與雙子葉植物較遠，本結論與李雪平等在禾本科植物綠竹和南荻的研究結果[16-17]類似，也與象草分類學中的位置一致。

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