梭羅草AFLP體系優化及指紋圖譜構建

王曉醒　李淑娟　謝永麗

摘要：利用梭羅草（Kengyilia thoroldiana）基因組DNA優化并建立的梭羅草擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）反應體系。預擴增反應體系25 μL：連接產物1 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 0375 μL，Mg2+ 1 μL，Taq DNA聚合酶05 μL，EcoRⅠ預擴引物1 μL，MseⅠ預擴引物12 μL，ddH2O加至 25 μL；選擴增反應體系25 μL：預擴產物（稀釋20倍）20 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 060 μL，Mg2+2 μL，TaqDNA聚合酶01 μL，EcoR Ⅰ選擴引物15 μL，Mse I選擴引物25 μL，ddH2O加至25 μL。利用優化后的AFLP體系，從梭羅草、大穎草（K grandiglumis）、疏花以禮草（K laxiflora）共10份供試材料中篩選出216對選擇性擴增引物，從中篩選出38對具有多態性的引物并從中選出6對條帶清晰、鑒別效率高的引物，其中E16C4、E4C10的擴增條帶中均有梭羅草的特征條帶，為梭羅草的種質鑒定及利用提供科學依據。

關鍵詞：梭羅草；指紋圖譜；AFLP體系；以禮草屬；預擴增；選擴增；引物；種質鑒定

中圖分類號： Q755文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0037-05

收稿日期：2016-04-14

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360578）。

作者簡介：王曉醒（1991—），女，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向為牧草飼料開發利用。E-mail：694840579@qqcom。

通信作者：李長慧，博士，教授，研究方向為牧草飼料開發利用。E-mail：746886595@qqcom。

梭羅草（Kengyilia thoroldiana）屬禾本科（Poaceae）以禮草屬（Kengyilia），是亞洲中部高寒草原特有種，抗逆性強，具下伸或橫走根莖，固土能力強、抗旱、耐寒，返青早、分蘗能力強，適應寒冷干旱的高寒草原和高寒荒漠生境，對三江源區的環境保護和小麥的品種改良有重要意義[1-4]。目前，對梭羅草的研究主要集中在生理生態及人工引種栽培方面[5-6]。

擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）結合了限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）和隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）技術的優點，具有快速高效、穩定可靠等優勢[7-8]，被廣泛應用于遺傳多樣性分析、種質鑒定、遺傳圖譜構建等研究[9-14]。焦湞等以3種禾本科作物為材料，建立并與優化了針對于禾本科作物的AFLP體系[15]。劉歡等建立并優化了燕麥的AFLP體系[16]。李娜對小麥的AFLP體系進行優化并證實該體系對近緣物種同樣適用[17]。AFLP過程比較復雜，針對不同物種有一定的特殊要求，因此AFLP體系優化成為AFLP分子標記研究的基礎工作。本研究以梭羅草為植物材料并以大穎草和疏花以禮草作為對比，探討AFLP分子標記各步驟的影響因素，優化對AFLP進行的正交設計及單因素試驗，建立穩定的AFLP分析體系并進一步構建梭羅草的指紋圖譜，為梭羅草種質鑒定、遺傳分化研究及種質資源保護建立基礎。

1材料與方法

11植物材料

本研究包括3個植物材料，共計10個居群（表1），每個居群隨機抽取10個單株提取基因組DNA樣本，稀釋至 50 ng/μL。并分別混合成10個基因池，作為AFLP分析的DNA模板。

12試劑、接頭與引物

限制性核酸內切酶Mse Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、DNA ladder，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物及接頭，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

13主要儀器

凝膠電泳使用北京六一生物科技有限公司生產的 DYY-12型電泳儀、JY-CX2A型槽電泳，2 000 V、100 mA、80 W。[JP]

14基因組DNA的酶切與連接

本研究基于已有的文獻資料[18]，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法提取供試材料基因組DNA并用核酸測定儀測定DNA的純度和濃度，每個居群提取10個單株的DNA，稀釋至50 ng/μL，于08%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并將各居群的10份DNA等量混合成基因池。

采用限制性核酸內切酶EcoR Ⅰ和MseⅠ對供試材料的基因池進行雙酶切，反應體系和條件參照劉歡等在燕麥研究中的方法[16]并略加改進，酶切后與EcoRⅠ和MseⅠ的特定接頭連接（表2）。

15預擴和選擴反應的正交試驗設計優化

預擴增反應以連接產物為模板DNA，采用25 μL體系，運用正交試驗設計對體系中的模板DNA、dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ對應預擴增引物（E+A、M+C）的用量進行優化，采用6因素5水平設計試驗（表3）。預擴增PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 80 s，20個循環；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。加上樣緩沖液混合后，在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳檢測預擴增引物的效果。

選擴增反應以預擴產物（稀釋20倍）為模板DNA，采用25 μL體系，運用正交試驗設計對體系中的模板DNA、dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ對應選擴增引物（E+ANN、M+CNN）的用量進行優化，采用6因素5水平設計試驗（表3）。選擴增PCR反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每循環降低07 ℃），72 ℃ 80 s，14個循環；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，23個循環；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。加上樣緩沖液混合后，在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳檢測選擴增引物的效果。endprint

16選擴增引物反應體系的單因素試驗設計

根據正交設計試驗優化的選擴增引物反應體系設計單因素試驗（表4）。對某一因素進行單因素設計時，其他因素采用正交試驗篩選出的水平。經PCR擴增后，在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳檢測選擴增引物反應效果。

17引物篩選與指紋圖譜構建

利用10份植物材料對216對AFLP選擴增引物組合進行初步篩選，獲得具有多態性的引物對，進一步篩選出引物擴增帶型清晰、對供試材料區鑒別率高的核心引物。指紋圖譜構建參照Pan的研究方法[19]，有AFLP片段的記為“A”，無AFLP片段的記為“C”。

[BT1#][STHZ]2結果與分析

21植物基因組DNA提取與檢測結果

18～20，08%瓊脂糖電泳條帶整齊一致，表明雜質去除較干凈，純度較高，可用于AFLP分析（圖1）。

22正交試驗設計優化

預擴增采用EA和MC引物對酶切片段進行擴增，體系中各因素用量均影響最終結果。正交試驗處理的試驗產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測（圖2）發現，預擴增片段在100～500 bp擴增信號較強，各樣品間相對一致，說明基因組DNA的提取和酶切連接體系比較合適；6個因素僅取值在兩端的水平組合選擇性片段擴增量較少（泳道1、10、18、22）或背景太深（泳道11、16、21），其他組合帶型較好。試驗結果表明，梭羅草AFLP預擴增反應體系各因素水平范圍寬泛，根據經濟適用原則確定預擴增反應體系：連接產物1 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 0375 μL，Mg2+1 μL，TaqDNA聚合酶05 μL，EcoR I預擴增引物1 μL，Mse I預擴引物12 μL，ddH2O補足至25 μL。

選擴增反應采用EA+GA和MC+CA對預擴增產物進行再次擴增。對上述優化過的預擴體系產生的預擴產物進行選擇性擴增體系優化，正交試驗處理的產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測發現，擴增片段在100～500 bp擴增信號較強，不同處理對選擴反應影響較大，僅試驗組合4、13、15、19、24、25相對帶型較好（圖3）。試驗結果表明，選擴體系設置的6因素中對結果影響較大的為dNTP和Mg2+（dNTPs濃度過低時，造成非特異性擴增增加，反之，則擴增產物會逐漸減少，Mg2+的影響效應與此相反），其次是引物、預擴產物、Taq DNA 聚合酶；初步確定最佳選擴反應體系：預擴產物（稀釋[CM（25]20倍）20μL，10×PCRBuffer25μL，dNTP075μL，

Mg2+ 2 μL，TaqDNA聚合酶01 μL，EcoRⅠ選擴引物15 μL，MseⅠ選擴引物25 μL，ddH2O補足至25 μL。

23單因素試驗設計優化

由正交試驗結果可知，dNTP、Mg2+、引物、預擴產物、Taq DNA 聚合酶對選擴體系影響較大，采用單因素試驗設計進一步研究，dNTP用量調整為060、065、070、075、080 μL。選擴增引物反應體系中單因素不同水平試驗電泳圖譜（圖4）結果表明，各因素水平控制良好，較好帶型均出現在各因素中值附近；進一步優化的選擴增反應體系（25 μL）：預擴產物（稀釋20倍）20 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 06 μL，[JP2]Mg2+2 μL， TaqDNA聚合酶01 μL， EcoR Ⅰ選擴引物 15 μL，[JP]Mse Ⅰ選擴引物25 μL，ddH2O補足至25 μL。

24引物篩選和指紋圖譜構建

對10份供試材料篩選216對選擇性擴增引物（圖5），從

中篩選出38對具有多態性的引物并從中選出6對條帶清晰，鑒別效率高的引物（表5），其中E16C4、E4C10（圖6）的擴增條帶中均有梭羅草的特征條帶。這6對AFLP引物組合的擴增產物共統計出28個AFLP多態性片段，因此這28個AFLP標記的有無，即為供試植物材料的指紋。由于任何單一引物對都不能獨自鑒定10份植物材料，所以本研究對10份植物材料構建E16C4、E3C16引物對的指紋圖譜（表6），以鑒別10份植物材料。

3結論與討論

本研究采用正交結合單因素試驗設計，兼顧各因素間的交互作用。試驗結果表明，梭羅草的AFLP分析對2種引物的用量需求并不相同，MseⅠ的預擴增引物和選擴增引物均略高于EcoRⅠ的預擴增和選擴增引物，這一點在之前的禾本科作物AFLP體系優化的國內相關文獻中并未提及。分析原因可[CM（25]能為AFLP擴增片段同時具有4個堿基的 MseⅠ和6個堿

注：A表示有AFLP標記片段；C表示無AFLP標記片段。[HT][FK）]

基的EcoRⅠ黏性末端，依據4種堿基隨機排列組合，MseⅠ的位點多于EcoRⅠ，則用量相對較少理論上是可行的。同樣，MseⅠ的預擴增引物和選擴增引物應略高于EcoRⅠ的引物。

DNA指紋圖譜構建是種質資源分子鑒定的基礎，常用的分子生物學方法很多。SSR和AFLP是構建DNA指紋圖譜的首選技術。本研究選取譜帶穩定性較好、鑒定效率較高的6對AFLP引物構建10份植物材料的DNA指紋圖譜，6對引物擴增結果不一致，表明此方法可以構建梭羅草的指紋圖譜數據庫。顯影結果中觀察到梭羅草的特征條帶（圖6），能直接將梭羅草與大穎草和疏花以禮草區別出來，可以用來鑒定梭羅草種質資源。

梭羅草是青藏高原高寒荒漠草原的優勢鄉土草種，對生態恢復和拓寬小麥育種的遺傳基礎具有重要意義。目前，針對于梭羅草的研究主要集中于宏觀方面，分子水平上的研究有待進一步發展。AFLP分子標記的引物在物種之間具有通用性，無須事前了解基因組的序列信息，是以分子水平研究梭羅草的良好接入點。為進一步利用AFLP分子標記研究梭羅草的遺傳多樣性、遺傳分化等建立了基礎。endprint

參考文獻：

[ZK（#]郭本兆 中國植物志（第九卷第3冊）[M] 北京：科學教育出版社，1987

李淑娟，李長慧，何國英，等 梭羅草的染色體核型分析[J] 安徽農業科學，2010，38（7）：3356-3357

[3]李長慧 梭羅草有性繁殖特性的研究[D] 北京：中國農業科學院，2014

[4]Jensen K B Genome analysis of Eurasian Elymus thoroldianus，E melantherus，and Ekokonoricus （Triticeae：Poaceae）[J] International Journal of Plant Sciences，1996，157（1）：136-141

[5]王佩羽 播種深度和施肥水平對梭羅草農藝性狀的影響[D] 西寧：青海大學，2013

[6]王佩羽，李長慧，李淑娟，等 4種牧草苗期耐鹽性比較[J] 草業科學，2013，30（4）：590-595

[7]Smith J J，Scott-Craig J S，Leadbetter J R，et al Characterization of random amplified polymorphic DNA （RAPD） products from Xanthomonas campestris and some comments on the use of RAPD products in phylogenetic analysis[J] Molecular Phylogenetics and Evolution，1994，3（2）：135-145

[8]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J] Nucleic Acids Research，1995，23（21）：4407-4414

[9]張俊紅，黃華宏，童再康，等 光皮樺6個南方天然群體的遺傳多樣性[J] 生物多樣性，2010，18（3）：233-240

[10][ZK（#]姜岳忠，董玉峰，馬玲，等 山東省主栽楊樹品種的AFLP分析與鑒定[J] 山東農業大學學報（自然科學版），2010，41（1）：17-22

[11]張瑞萍，吳俊，李秀根，等 梨AFLP標記遺傳圖譜構建及果實相關性狀的QTL定位[J] 園藝學報，2011，38（10）：1991-1998

[12]尤衛艷，黃華宏，童再康，等 光皮樺AFLP分子標記體系的建立[J] 生物技術，2008，18（6）：42-45

[13]Becker J，Vos P，Kuiper M，et al Combined mapping of AFLP and RFLP markers in barley[J] Molecular Genetics and Genomics，1995，249（1）：65-73

[14]李東，吳先軍，陳新 熱脅迫下丹參轉錄組cDNA-AFLP分析[J] 中草藥，2011，42（10）：2083-2091

[15]焦湞，孫營，李娜，等 禾本科作物基因組AFLP分析體系的建立及優化[J] 華北農學報，2007，22（4）：108-111

[16]劉歡，趙桂琴，耿小麗，等 燕麥AFLP反應體系的建立與優化[J] 草業科學，2008，25（2）：84-89

[17]李娜 AFLP體系的優化與小麥T5代高蛋白株的AFLP分析[D] 鄭州：鄭州大學，2006

[18]Doyle J J A rapid DNA isolation procedure for small amounts of fresh leaf tissue[J] Phytochemical Bulletin，1987，19（1）：11-15

[19]Pan Y B Highly polymorphic microsatellite DNA markers for sugarcane germplasm evaluation and variety identity testing[J] Sugar Tech，2006，8（4）：246-256endprint