甘蔗葉內(nèi)生真菌的多樣性

周寧　趙曉璐　謝慶武

摘要：從甘蔗葉中分離出內(nèi)生真菌并對(duì)其多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從不同季節(jié)和不同葉片部位的甘蔗葉中共分離到172株內(nèi)生真菌，通過(guò)菌落形態(tài)學(xué)特征和ITS序列鑒定這些內(nèi)生真菌分屬為8屬10種；從夏季的葉片中分離到6屬8種，冬季的葉片中分離到7屬9種；從老葉中分離到全部的8屬10種，幼葉中分離到5屬6種。主要優(yōu)勢(shì)種為曲霉屬（Aspergillus sp）和炭疽菌屬（Colletotrichum sp），兩者占總菌株分離數(shù)的85%以上。

關(guān)鍵詞：甘蔗葉；內(nèi)生真菌；多樣性；分離；鑒定

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0093-03

收稿日期：2016-04-07

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃（編號(hào)：P3130098105）。

作者簡(jiǎn)介：周寧（1990—），男，河南新蔡人，碩士研究生，主要從事微生物制藥的研究。E-mail：zhaoxiaoluw@126com。

通信作者：謝慶武，碩士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物技術(shù)的研究。E-mail：xqw@gxueducn。

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指其生活史中的部分或全部階段定植于健康植物組織內(nèi)，不造成宿主植物明顯傷害的真菌，包括表生的腐生菌、潛伏性的病原菌和菌根菌。研究表明，植物內(nèi)生真菌具有多種應(yīng)用價(jià)值，其部分代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗菌[3]、抗氧化[4]等多種藥用活性；植物內(nèi)生真菌與其宿主植物同樣也有較為緊密的關(guān)系，能夠調(diào)節(jié)宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5]、增強(qiáng)宿主植物的抗逆性，影響宿主植物根部的土壤環(huán)境及微生物群落和生物防治植物病蟲害等[8]。甘蔗是重要的制糖經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)南方等地均有廣泛種植，甘蔗葉作為甘蔗植株進(jìn)行光合作用的主要部位，其內(nèi)生真菌的多樣性分布可能對(duì)甘蔗植株的糖產(chǎn)量及品質(zhì)有較高影響，但國(guó)內(nèi)對(duì)甘蔗葉內(nèi)生真菌的種類及分布情況鮮有研究。本研究主要對(duì)甘蔗葉內(nèi)生真菌進(jìn)行分離及鑒定，以期了解甘蔗葉內(nèi)生真菌的多樣性，為合理開發(fā)利用甘蔗葉內(nèi)生真菌資源提供依據(jù)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用新鮮甘蔗葉采自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田。植物DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。次氯酸鈉、乙醇、葡萄糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要培養(yǎng)基為：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH值自然）和PDB培養(yǎng)基（馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH值自然）。

12試驗(yàn)方法

121內(nèi)生真菌的分離與純化

采用組織分離法分離甘蔗葉內(nèi)生真菌[9]。具體操作步驟為：取新鮮健康的甘蔗葉片用蒸餾水清洗干凈，切成長(zhǎng)條狀，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)。首先使用活性氯含量為22%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次；然后用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡消毒1 min，無(wú)菌水沖洗3次；用無(wú)菌剪刀將消毒后的葉片剪碎至長(zhǎng)為2～4 mm 的小塊，分別置于PDA平板上，每板等距放置7塊，28 ℃ 下培養(yǎng)3～5 d。待葉片周圍長(zhǎng)出足量菌絲體后，依據(jù)真菌的形態(tài)特征并采用平板劃線法進(jìn)行菌株的純化。純化后的菌種保存至4 ℃冰箱備用。

122內(nèi)生真菌的鑒定

菌落形態(tài)特征：取純化后的菌種接種至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，定期觀察、記錄各菌株生長(zhǎng)過(guò)程中的菌落形態(tài)特征，并依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：取純化后的菌種經(jīng)PDB發(fā)酵后采用DNA提取試劑盒進(jìn)行總DNA的提取，使用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增其58S rDNA-ITS序列。擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后由深圳華大基因測(cè)序。

123數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序后得到的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性檢索，并通過(guò)軟件MEGA60進(jìn)行聚類分析，采用鄰接法（Neighbor-Joining），設(shè)置重復(fù)次數(shù)為1 000次、bootstrap值≥50%構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

21甘蔗葉內(nèi)生真菌的分離與鑒定

211內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特征

從甘蔗葉中共分離到172株內(nèi)生真菌，依據(jù)真菌的菌落形態(tài)特征初步判斷有10種不同的菌株（表1、圖1），具體種屬須要依據(jù)分子生物學(xué)準(zhǔn)確鑒定。

212內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步判斷的10種不同的甘蔗葉內(nèi)生真菌進(jìn)行ITS序列的擴(kuò)增，均獲得大小為500 bp左右的目的條帶（圖2），獲得的ITS序列測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。依據(jù)序列的相似性原理進(jìn)行菌種鑒定，其中相似性≥99%時(shí)可鑒定至種，相似性≥95%時(shí)可鑒定至屬。結(jié)果表明，172株甘蔗葉內(nèi)生真菌分別屬于8屬10種，其中優(yōu)勢(shì)菌群主要為曲霉屬（Aspergillus sp）、炭疽菌屬（Colletotrichum sp），分別占分離數(shù)的541%、314%。

22甘蔗葉內(nèi)生真菌的分布

221不同葉片部位內(nèi)生真菌的分布

從老葉中共分離到8屬10種內(nèi)生真菌，分別為玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）、塔地囊孢殼菌（Glomerella tucumanensis）、意大利果皮葉點(diǎn)霉（Phyllosticta capitalensis）、喙突臍蠕孢（Exserohilum rostratum）、膠孢炭疽菌（C gloeosporioides）、小球腔菌屬（Leptosphaeria sp）、博寧炭疽菌（C boninense）、炭角菌屬（Xylaria sp）、黑曲霉（A niger）、棘孢曲霉（A aculeatus）；從幼葉中共分離到5屬6種內(nèi)生真菌，分別為塔地囊孢殼菌、意大利果皮葉點(diǎn)霉、喙突臍蠕孢、膠孢炭疽菌、博寧炭疽菌、棘孢曲霉。表明不同葉片部位的內(nèi)生真菌的分布有著較為明顯的差異，老葉比幼葉具有更豐富的內(nèi)生真菌種類分布。

222不同季節(jié)內(nèi)生真菌的分布

從夏季的葉片中共分離到6屬8種內(nèi)生真菌，分別為玉蜀黍赤霉菌、塔地囊孢殼菌、意大利果皮葉點(diǎn)霉、膠孢炭疽菌、小球腔菌屬、博寧炭疽菌、黑曲霉、棘孢曲霉；從冬季的葉片中共分離到7屬9種內(nèi)生真菌，分別為塔地囊孢殼菌、意大利果皮葉點(diǎn)霉、喙突臍蠕孢、膠孢炭疽菌、小球腔菌屬、博寧炭疽菌、炭角菌屬、黑曲霉、棘孢曲霉。其中，玉蜀黍赤霉菌僅在夏季的葉片中發(fā)現(xiàn)，喙突臍蠕孢和炭角菌屬僅在冬季的葉片中出現(xiàn)，表明不同季節(jié)甘蔗葉內(nèi)生真菌有著不同的種群分布。

3結(jié)論與討論

甘蔗葉中共分離到172株內(nèi)生真菌，通過(guò)菌落形態(tài)學(xué)

特征和ITS序列分析鑒定這些內(nèi)生真菌分屬8屬10種，其中玉蜀黍赤霉菌、塔地囊孢殼菌、意大利果皮葉點(diǎn)霉、喙突臍蠕孢、膠孢炭疽菌、博寧炭疽菌為常見的植物病原菌，常常引起各種植物的病害。玉蜀黍赤霉菌是玉米穗腐病的主要病原菌之一[10]，塔地囊孢殼菌是引起甘蔗赤腐病的病原菌[11]，意大利果皮葉點(diǎn)霉普遍存在于各種柑橘中常引起柑橘的黑斑病[12]，喙突臍蠕孢經(jīng)常感染香蕉葉造成香蕉的葉斑病，膠孢炭疽菌和博寧炭疽菌可以感染多種植物造成植物的炭疽病[14-17]。甘蔗葉內(nèi)生真菌的主要優(yōu)勢(shì)種為曲霉屬和炭疽菌屬，兩者占總分離數(shù)的85%以上，不同季節(jié)和不同葉片部位內(nèi)生真菌的多樣性分布也有較高的不同。和文獻(xiàn)[18]比對(duì)后發(fā)現(xiàn)除炭角菌屬以外其他內(nèi)生真菌均為首次在甘蔗葉中發(fā)現(xiàn)，表明不同地域條件對(duì)甘蔗葉內(nèi)生真菌的多樣性分布具有很高的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，甘蔗葉內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，對(duì)研究部分植物的致病菌傳播方式及甘蔗葉內(nèi)生真菌的開發(fā)利用具有一定的價(jià)值。

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