T—RFLP技術在土壤微生物群落多樣性分析中的研究進展

馬琳+張衛華+劉淼

摘 要：土壤微生物群落多樣性在保證作物健康生長、提高土壤質量、實現農業可持續發展等方面都具有十分重要的意義，研究方法的選擇尤為關鍵，T-RFLP技術因其能快速獲得大量數據、靈敏度高且穩定性好，近年來廣泛應用于土壤微生物多樣性研究中，本文從原理方法、重要環節及實際應用3個方面介紹T-RFLP技術，分析其局限性，并對其應用前景進行展望，旨在為土壤微生物群落分析研究提供更可靠、高效的方法。

關鍵詞：T-RFLP；土壤微生物；多樣性分析

中圖分類號：S182 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170932217

微生物是土壤生物的重要組成部分，極大地影響著土壤中營養元素的循環、肥力的形成，在改善生態環境方面也起著非常重要的作用[1]。開展對土壤微生物多樣性的研究，不僅能了解土壤的養分情況、預測土壤的環境質量變化，還可以知道土壤中微生物的種類及其功能。T-RFLP技術具有較高的分辨率、精確度和靈敏度，且能夠迅速獲得大量數據，準確、快速、真實地反映土壤微生物的多樣性[2]，近年來被廣泛應用于土壤微生物群落多樣性的分析中。

1 T-RFLP技術的基本原理和方法

末端限制性片段長度多態性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism， T-RFLP），是以分子生物學技術為基礎的較為先進的微生物群落研究方法，它是PCR技術、熒光標記技術、DNA限制性酶切技術和DNA序列自動分析技術的綜合運用。

該技術要依據微生物的比較基因組學信息，確定合適的DNA目的序列，然后根據基因的保守區設計通用引物，其中1個引物的5端用熒光物質標記，常用的熒光物質有：四氯熒光素TET，綠色的六氯熒光素HEX和藍色的六羧基熒光素6-FAM。提取樣品中的總DNA，以總DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物純化后用四堿基限制性內切酶酶切，消化產物在自動測序儀上進行檢測，就可以檢測出末端被熒光標記了的限制性片段，得到末端片段峰，而未用熒光標記的片段是檢測不到的。不同的末端片段峰代表不同種類的微生物，所以通過峰高或峰面積的大小、峰的數量可以判斷出微生物群落的結構、功能及其變化情況[3]。

2 T-RFLP技術應注意的環節及優化

2.1 土壤微生物總DNA的提取

提取土壤中微生物總DNA是運用T-RFLP技術的關鍵步驟，總DNA的產量和純度會直接影響實驗結果。土壤微生物DNA的提取方法有2種，分別是直接提取法和間接提取法。直接提取法是通過化學、物理或酶等手段直接作用于土壤，破壞其微生物細胞，釋放出DNA分子，然后將DNA純化；間接提取法是先將微生物從土壤中分離出來，然后進行DNA的提取和純化。Leff等[4]分析比較了2種提取方法，結果發現2種方法各有優劣：直接提取法提取的DNA產量較高，但DNA損傷比較嚴重；間接提取法能獲得純度較高的DNA，但產量較低。近年來，土壤DNA提取試劑盒因其提取速度快、效果好、DNA純度高而受到廣泛關注，用試劑盒提取出來的DNA更適合做PCR擴增分析，因此，在經濟允許的條件下，盡量采用試劑盒法提取土壤微生物的總DNA。

2.2 限制性內切酶的選擇

選擇能夠明顯區分不同微生物的四堿基限制性內切酶，即酶切后產生的末端片段峰的大小有明顯的差別，應盡量避免只相差1個堿基的情況，確保消化反應得到的單峰具有特異性，盡量減少雜峰的產生。需要注意的是，由于雜峰的存在會嚴重影響對樣品微生物的分析和認識，所以不能單純地將產生末端限制性片段的數量作為限制性內切酶的選擇標準，應用純培養物檢驗后再對樣品進行分析，確保選擇到合適的限制性內切酶。還可以選用多個限制性內切酶進行酶切，然后綜合不同酶的酶切結果，這樣可以大大提高檢出效率。采用多種酶進行酶切時，不能將幾個酶在同一個反應體系中進行，需要它們在各自的反應體系中分別進行酶切，因為雙酶切有可能比單酶切產生的TRF還要少[5]。

2.3 圖譜的解讀

DNA測序儀的熒光檢測器可以檢測到帶有熒光標記物質的限制性片段（T-RF），對應到T-RFLP圖譜上就是各個“峰”，峰的橫坐標表示片段長度，是在比較各片段與標樣中已知的DNA片段在電泳中的位置后，通過計算得到的；峰的縱坐標表示帶有熒光物質T-RF的熒光強度，峰面積則表示片段長度相同的所有T-RF的熒光強度之和，分析圖譜的時候，通常將每個T-RF作為一個“OTU”（operational taxonomic unit），根據圖譜中OTU的數目及其豐度計算多樣性指數、均勻度指數等指標，進行群落多樣性的分析研究。

3 T-RFLP技術在土壤微生物多樣性研究中的應用

3.1 T-RFLP圖譜直觀分析

T-RFLP圖譜可以反映出樣品的很多信息，片段長度、熒光強度、豐富度等指標可采用直接觀察法進行直觀分析，一些研究將T-RFLP圖譜進行比較，初步判斷不同處理間是否存在差異：陳冬梅等[6]通過比對白肋煙不同種植年限的T-RFLP圖譜發現，其根際細菌群落在團棵期和成熟期均呈現明顯差異；張重義等[7]采用該方法分析得出，在塊根膨大期，不同種植年限地黃根際細菌群落存在明顯差異。還有些研究則根據T-RFLP圖譜判斷物種豐富度的變化趨勢：楊宇虹等[8]將連作煙草根際土壤的T-RFLP圖譜與對照處理進行比較，發現連作會使煙草根際土壤細菌群落數量減少，物種豐富度降低，趨于單調。封曄等[9]研究了8種植物根際細菌的多樣性，發現8個T-RFLP圖譜均有較多峰，且峰值間的差異較大，說明8種植物根際細菌的豐富度較高，但在數量、片段大小上存在一定差異。直接觀察法只能對數據進行初步的判斷分析，更深入的數據解析如多樣性分析、聚類分析、冗余分析等還需要借助統計學、生物數學的算法以及Excel、SPSS等數據處理軟件。endprint

3.2 微生物多樣性指數分析

多樣性指數是土壤微生物群落多樣性的重要指標，可根據T-RFLP圖譜的OTU數目及其豐度計算多樣性指數，然后用Biological Tools軟件對其進行分析。不同的施肥制度會直接影響到農作物的生長及其產量，還會使土壤的理化性狀發生改變，從而改變土壤微生物的數量、活性及群落結構組成。曾希柏等[10]分析了不同施肥模式下設施菜地的細菌群落，發現Shannon指數、Evenness指數和Simpson指數在1/2MNPK處理0～20cm表層土壤中數值最大，說明不同施肥處理細菌的豐度及優勢種群有顯著差異，且表層土壤的微生物比較豐富。不同植物的根系分泌物對不同種類的土壤微生物有不同的影響，比如某個植物的根系分泌物會促進一些土壤微生物的生長，而對其他土壤微生物產生抑制作用。封曄等[9]分別計算了8種植物根際細菌的Shannon指數和Evenness指數，結果表明，六道溝流域內樹種的不同是導致根際細菌多樣性出現差異的因素之一。秦越等[11]對馬鈴薯連作栽培土壤進行微生物多樣性分析，發現連作栽培馬鈴薯后土壤細菌和真菌DNA仍具有較高的T-RFLP多態性，但不同連作年限的根際土壤，其優勢T-RFs片段不同，且長年連作會導致某些T-RFs消失。

4 T-RFLP技術的局限性及應用前景

T-RFLP技術在研究土壤微生物群落多樣性領域中，不論是從技術本身的靈敏度和精確度來看，還是從實驗經費方面考慮，都具有很大的優勢，但也存在一些局限性：T-RFLP技術前期需要進行PCR擴增和限制性內切酶酶切，如果近緣種微生物在擴增片段靠近熒光標記端的切點一樣時，T-RFLP圖譜上的1個峰就有可能代表多種微生物，因此無法區分近緣種微生物[12]；T-RFLP技術只能根據原始數據計算出每個片段的相對豐度，因而得到的結果只能看出各類微生物所占比例，并不能確定某一生態系統中各類微生物的絕對含量，即便某些微生物在數量上有所改變，單從相對比例上也無法準確地看出其變化趨勢；在原始數據的處理時，片段長度范圍的確定、噪聲峰的去除及大小相近的片段合并都會對結果造成影響，尤其是片段的合并存在很大的人為因素，不同的人處理的數據會有所差異，導致結果出現偏差，不能非常準確地反映土壤微生物群落結構。

盡管T-RFLP技術在某些方面存在一定的局限性，但綜合來看，該技術仍是分析土壤微生物群落多樣性的理想方法之一。近年來核酸測序技術的不斷發展、數據庫中核酸序列的不斷豐富，因此利用分子手段分析土壤微生物群落多樣性已成為必然趨勢。隨著T-RFLP技術自身參數的不斷優化，再結合實時熒光定量PCR、克隆等定量分析技術，該技術必將會在土壤微生物群落分析研究中發揮更大的作用。

參考文獻

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