申克孢子絲菌酵母相對人THP?1巨噬細胞樣細胞p38MAPK激活及白細胞介素6表達的影響

劉彩霞 杜蕾蕾 段志敏 曾榮 沈永年 胡素泉 劉維達 陳青 李岷

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所真菌科（劉彩霞、杜蕾蕾、段志敏、曾榮、沈永年、胡素泉、劉維達、李岷）；江蘇省血液中心研究室（陳青）

申克孢子絲菌酵母相對人THP?1巨噬細胞樣細胞p38MAPK激活及白細胞介素6表達的影響

劉彩霞 杜蕾蕾 段志敏 曾榮 沈永年 胡素泉 劉維達 陳青 李岷

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所真菌科（劉彩霞、杜蕾蕾、段志敏、曾榮、沈永年、胡素泉、劉維達、李岷）；江蘇省血液中心研究室（陳青）

目的探討申克孢子絲菌酵母相對人急性單核細胞白血病細胞（THP?1）巨噬細胞樣細胞p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活化及白細胞介素6（IL?6）表達的影響。方法實時熒光定量反轉錄PCR分析申克孢子絲菌酵母相刺激THP?1巨噬細胞樣細胞3、6 h后IL?6 mRNA表達水平變化，酶聯免疫吸附法檢測刺激24 h后IL?6分泌量；Western印跡法分析2×106CFU/ml申克孢子絲菌酵母相體外作用于THP?1巨噬細胞樣細胞30 min和60 min后p38MAPK磷酸化水平的變化，同時檢測100 nmol/L地塞米松（p38MAPK抑制劑）預處理THP?1巨噬細胞樣細胞30 min后p38MAPK磷酸化水平及IL?6 mRNA表達水平的變化。采用SPSS19.0統計軟件，進行多因素方差分析、單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗。結果刺激THP?1巨噬細胞樣細胞3 h后，酵母相組、凝膠多糖組、空白對照組IL?6 mRNA表達水平分別為56.81±7.36、26.69±1.22、0.97±0.05，刺激6 h后分別為378.03±16.67、276.24±39.13、1.02±0.04，組間差異有統計學意義（F=5 552.22，P＜0.001）。申克孢子絲菌酵母相刺激6 h后IL?6 mRNA表達高于刺激3 h后（q=16.74，P＜0.001），申克孢子絲菌酵母相與THP?1巨噬細胞樣細胞共孵育24 h后，酵母相組、凝膠多糖組及空白組細胞上清液中IL?6濃度分別為（59.96± 18.16）、（91.01± 17.27）、（5.50± 2.30）pg/L，組間差異有統計學意義（F=26.62，P＜0.01）；酵母相組高于空白對照組（P＜0.01）。地塞米松處理后，酵母相組IL?6 mRNA表達水平（4.46±1.03）低于未用地塞米松處理組（493.52±113.87，P＜0.001）。申克孢子絲菌酵母相作用THP?1巨噬細胞樣細胞30、60 min后，磷酸化p38MAPK蛋白相對表達量均高于空白對照組（P＜0.01）。地塞米松預處理THP?1巨噬細胞樣細胞后，磷酸化p38MAPK水平低于未用地塞米松處理組，差異有統計學意義（q=10.81，P＜0.01）。結論人THP?1巨噬細胞樣細胞體外與申克孢子絲菌酵母相作用后，通過激活p38MAPK信號通路促進IL?6表達。

孢子絲菌屬；巨噬細胞；白細胞介素6；p38絲裂原活化蛋白激酶類

作為一種致病性雙相真菌，申克孢子絲菌（Sporothrix schenckii）室溫下呈菌絲相，在感染部位轉化為酵母相后可致病，引起皮膚黏膜、皮下組織及局部淋巴組織的感染，病重者可經血行或淋巴管播散至骨骼和內臟等，引起全身性系統感染，甚至危及生命［1］。宿主單核巨噬細胞能夠識別并吞噬、殺傷、清除入侵的申克孢子絲菌，在機體抵抗申克孢子絲菌感染中發揮重要作用［2］。本研究旨在探討申克孢子絲菌酵母相（簡稱酵母相）對人急性單核細胞白血病細胞（THP?1）巨噬細胞樣細胞p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路激活與白細胞介素6（IL?6）表達的影響。

材料和方法

一、主要試驗材料

THP?1細胞株來自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。申克孢子絲菌標準株CMCC（F）D1a由中國微生物菌種保藏管理委員會醫學真菌中心提供。兔抗人p38MAPK、p38MAPK磷酸化蛋白（p?p38MAPK）和β肌動蛋白抗體（美國Cell Signaling Technology公司），IL?6酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），反轉錄酶試劑盒（PrimeScript RT Master Mix）（日本TaKaRa公司），熒光定量PCR試劑盒（iTaq Universal SYBR Green Supermix）（美國Bio?rad公司），佛波酯、凝膠多糖（美國Sigma公司），地塞米松（美國Invivogen公司）。

二、試驗方法

1.酵母相誘導：申克孢子絲菌接種至沙堡弱固體培養基25℃培養7 d，活化3次后轉種于含2%葡萄糖的腦心浸液瓊脂培養基37℃、5%CO2下培養，每14 d傳代，觀察菌落及革蘭染色后顯微鏡下形態，至完全轉化為酵母相后制備酵母相菌液，生理氯化鈉溶液沖洗2遍，計數后配制成2×109菌落形成單位（CFU）/ml的菌懸液待用。

2.THP?1巨噬細胞樣細胞培養：THP?1細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養、傳代。將細胞制備成2×105/ml細胞懸液，接種于12孔細胞培養板（每孔1 ml）及6孔細胞培養板（每孔2 ml），加入100 μg/L佛波酯刺激48 h誘導形成巨噬細胞待用。

3.酵母相對THP?1巨噬細胞樣細胞IL?6表達水平的影響：將THP?1巨噬細胞樣細胞與2×106CFU/ml酵母相（酵母相組）、100 mg/L IL?6陽性刺激物凝膠多糖（凝膠多糖組）或培養基（空白對照組）共培養，分別于培養3、6 h后檢測IL?6 mRNA的表達。

根據預實驗，酵母相刺激THP?1巨噬細胞樣細胞后，ELISA檢測到上清液IL?6含量明顯升高，且刺激24 h后上清液IL?6含量達到最高。于共培養24 h時ELISA檢測各組細胞上清液中IL?6的表達。

4.酵母相對THP?1巨噬細胞樣細胞p38MAPK通路的影響：酵母相及凝膠多糖分別與THP?1巨噬細胞樣細胞共培養30、60 min后檢測p38MAPK蛋白及p?p38MAPK蛋白的表達水平。

5.地塞米松對酵母相刺激的THP?1巨噬細胞樣細胞IL?6 mRNA表達及p38MAPK通路的影響：將酵母相、凝膠多糖分別與100 nmol/L地塞米松預處理30 min的THP?1巨噬細胞樣細胞和未用地塞米松處理的THP?1巨噬細胞樣細胞共培養30 min時檢測各組p?p38MAPK的表達水平，培養6 h時檢測各組IL?6 mRNA的表達水平。

6.實時熒光定量反轉錄PCR檢測IL?6 mRNA的表達：TRIzol試劑盒抽提處理后THP?1總RNA，按反轉錄酶試劑盒說明書將總RNA反轉錄為cDNA，使用ABI 7300 PCR儀（美國ABI公司）對目的基因進行擴增。以β肌動蛋白作為內參照，IL?6及β肌動蛋白引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列：IL?6：正向引物5′?TTCGGCAAATG TAGCATG?3′，反向引物5′?AATGGGCAAATGTAGC ATC?3′；β肌動蛋白：正向引物5′?TCTGGCACCACA CCTTCAT?3′，反向引物5′?AGGCATACAGGGACAG CAC?3′。PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環數40。采用2-△△Ct法計算目的基因的變化水平，△Ct=目的基因-內參照（β肌動蛋白）；△△Ct=樣品△Ct-對照組△Ct。2-△△Ct值為實驗組目的基因的表達較對照組目的基因表達的倍數。

7.Western印跡法檢測p38MAPK蛋白及p?p38MAPK蛋白的表達：收集處理后的THP?1巨噬細胞樣細胞，蛋白裂解液裂解細胞，提取總蛋白。用二喹啉甲酸定量法計算蛋白濃度，煮沸變性，SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉至聚偏二氟乙烯膜上。5%血清白蛋白（BSA）封閉2 h，兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體孵育2 h，化學發光底物顯色發光。實驗至少重復3次取均值。

8.統計學處理：采用SPSS19.0統計軟件，實驗數據以±s表示，進行多因素方差分析、單因素方差分析，組間多重比較采用LSD、Dunnett及Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、酵母相對THP?1巨噬細胞樣細胞IL?6 mRNA及IL?6表達水平的影響

見表1。刺激3 h和6 h后，酵母相組、凝膠多糖組、空白對照組IL?6 mRNA表達水平差異有統計學意義（F=5 552.22，P＜ 0.001）。刺激6 h后IL?6 mRNA表達與刺激3 h后之間差異有統計學意義（F=1 994.31，P＜ 0.001）。酵母相刺激后6 h IL?6 mRNA表達高于刺激后3 h（t=16.74，P＜0.001）。

酵母相與THP?1巨噬細胞樣細胞共孵育24 h后，酵母相組、凝膠多糖組及空白對照組的上清液中IL?6濃度差異有統計學意義（F=26.62，P＜0.01）。酵母相組高于空白對照組，差異有統計學意義（q=4.59，P＜ 0.01）。

無論是否用地塞米松處理，酵母相組、凝膠多糖組及空白組之間IL-6 mRNA表達水平差異有統計學意義（F=19 893.26，P＜0.001）。地塞米松處理的3組IL?6 mRNA表達水平與未用地塞米松處理的3組間差異有統計學意義（F=202.86，P＜0.001）；酵母相組地塞米松處理后IL?6 mRNA表達水平低于未用地塞米松處理組（q=10.42，P＜0.001）。見表2。

表1 申克孢子絲菌酵母相對THP?1巨噬細胞樣細胞IL?6 mRNA及分泌水平的影響（±s）

表1 申克孢子絲菌酵母相對THP?1巨噬細胞樣細胞IL?6 mRNA及分泌水平的影響（±s）

注：n=3。a：與共培養后3 h比較，差異有統計學意義（P＜0.01）

組別申克孢子絲菌組凝膠多糖組空白對照組IL?6 mRNA共培養3 h 56.81±7.36 26.69±1.22 0.97±0.05共培養6 h 378.03±16.67a 276.24±39.13a 1.02±0.04共培養24 h IL?6（pg/L）59.96±18.16 91.01±17.27 5.50±2.30

表2 地塞米松對申克孢子絲菌酵母相上調THP?1巨噬細胞樣細胞IL?6 mRNA水平的影響（±s）

表2 地塞米松對申克孢子絲菌酵母相上調THP?1巨噬細胞樣細胞IL?6 mRNA水平的影響（±s）

注：n=3。a：與空白對照組比較，P ＜ 0.01；b：與未用地塞米松阻斷組比較，P＜0.01；c：與未用地塞米松阻斷組比較，P＜0.05

組別酵母相組凝膠多糖組空白對照組未用地塞米松阻斷493.52±113.87a 274.12±15.44a 1.60±0.35地塞米松阻斷4.46±1.03b 11.44±3.32c 1.04±0.24

二、酵母相對THP?1巨噬細胞樣細胞p38MAPK通路的影響

見圖1。刺激30 min后，酵母相組p?p38MAPK蛋白相對表達量為2.31±0.31，p38MAPK蛋白為1.14±0.09；刺激60 min后分別為2.19±0.06和1.12± 0.10。空白對照組（刺激0 min）p?p38MAPK蛋白、p38MAPK蛋白均為1.00。p?p38MAPK蛋白相對表達量組間差異有統計學意義（F=380.186，P＜0.001），刺激30、60 min后酵母相組p?p38MAPK蛋白相對表達量高于空白對照組（q=6.75、6.13，均P＜0.01）。p38MAPK蛋白相對表達量組間差異無統計學意義（F=0.07，P=0.81）。

地塞米松處理后，酵母相組p?p38MAPK蛋白相對表達量為2.29±0.37，空白對照組為1.13±0.04；未用地塞米松處理時，酵母相組p?p38MAPK蛋白相對表達量為4.55±0.46，空白對照組為1.00±0.00，組間差異有統計學意義（F=61.69，P＜0.001）。地塞米松處理后酵母相組p?p38MAPK蛋白表達低于未用地塞米松處理酵母相組（q=10.81，P＜0.01）。見圖2。

討 論

申克孢子絲菌在宿主體內和37℃培養時為酵母相，且孢子絲菌病患者的組織病理切片和電鏡標本中僅見酵母相［3］，故本研究選用酵母相為研究對象。THP?1細胞是一種人急性單核細胞白血病細胞，經PMA誘導可分化為成熟的巨噬細胞，常用于單核-巨噬細胞的功能研究，故本研究選用經PMA誘導的THP?1巨噬細胞樣細胞作為細胞模型。

圖1 申克孢子絲菌酵母相對THP?1巨噬細胞樣細胞p38MAPK通路的影響 與空白對照組比較，申克孢子絲菌酵母相刺激30、60 min時磷酸化p38MAPK蛋白水平明顯升高，而p38MAPK蛋白水平均無變化

圖2 地塞米松對申克孢子絲菌酵母相激活THP?1巨噬細胞樣細胞p38MAPK通路的影響 地塞米松預處理后申克孢子絲菌酵母相誘導的磷酸化p38MAPK水平降低，p38MAPK蛋白水平無明顯改變

以往研究顯示，單核細胞、巨噬細胞等固有免疫細胞能快速識別、吞噬清除入侵機體的病原真菌并合成分泌IL?1β、IL?6、IL?12、IL?17、IL?22、腫瘤壞死因子（TNF?α）等多種細胞因子，在機體抵御申克孢子絲菌感染中發揮重要作用［4?11］。IL?6是一種多效性前炎癥因子，通過誘導急性時相反應蛋白合成、增強吞噬細胞功能等發揮抗感染效應。IL?6可由幾乎所有的基質細胞和免疫細胞分泌，而TNF?α、IL?1β能促進IL?6表達，表達過程受多種細胞信號通路調控［12］。IL?6可促進T淋巴細胞增殖、分化和生長，IL?6缺失嚴重影響固有免疫及適應性免疫的轉換［13］。

本研究發現，酵母相刺激THP?1巨噬細胞樣細胞后，IL?6 mRNA表達水平呈現時間依賴效應，刺激3 h后表達水平上升，6 h表達水平為3 h時的6.65倍。凝膠多糖是一種β?1，3-D-葡聚糖，被單核巨噬細胞表面受體C-型凝集素受體1（Dectin?1）識別后，激活細胞內信號通路，合成分泌多種細胞因子［14］。我們選用凝膠多糖作為激活THP?1巨噬細胞樣細胞的陽性對照物，實驗中誘導IL?6 mRNA表達與酵母相有相似的時間依賴性效應，刺激6 h后IL?6 mRNA水平比3 h時升高10.35倍。酵母相作用THP?1巨噬細胞樣細胞24 h后，上清液中IL?6蛋白含量較空白對照組明顯升高，表明酵母相不僅在mRNA水平誘導THP?1巨噬細胞樣細胞上調IL?6轉錄，還在蛋白水平提高其分泌量。Sassá等［5］和de C Negrini等［10］用申克孢子絲菌脂類抗原刺激野生小鼠腹腔巨噬細胞或脾細胞，能誘發炎癥反應，使IL?6、IL?1β等表達增加。

Romo?Lozano等［6］用酵母相刺激肥大細胞，通過激活ERK信號通路，誘導IL?6、TNF?α分泌，引發固有免疫反應。樹突細胞受酵母相或外抗原100刺激后，IL?6、IL?12等表達增加［11］。角質形成細胞與酵母相或分生孢子共孵育后，IL?6、IL?8等細胞因子轉錄及翻譯水平均明顯升高［15］。本研究結果與上述研究一致，提示IL?6在抗申克孢子絲菌感染中發揮重要作用。

真菌入侵機體后，細胞因子的產生依賴于固有免疫細胞通過模式識別受體識別真菌表面病原體相關分子模式，活化下游信號通路MAPK等［16］。MAPK主要包括ERK、p38MAPK及c?Jun氨基末端激酶（JNK）幾個亞族，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡等多功能調控。既往研究發現，THP?1巨噬細胞樣細胞通過活化p38MAPK信號通路并分泌TNF?α等細胞因子，參與抗念珠菌感染的免疫反應［17］。本研究中酵母相刺激THP?1巨噬細胞樣細胞30 min和60 min后，p38MAPK磷酸化水平均升高，表明酵母相能夠激活p38MAPK信號通路。

研究證明，100 nmol/L地塞米松能阻斷p38MAPK信號通路并抑制IL?6等細胞因子的表達［18］。本研究中，100 nmol/L地塞米松預處理THP?1巨噬細胞樣細胞后抑制了酵母相誘導的p38MAPK通路的磷酸化并使IL?6 mRNA表達明顯降低，進一步證明100 nmol/L地塞米松可通過阻斷p38MAPK通路影響下游IL?6的表達。但地塞米松為非特異性阻斷劑，不能排除對實驗的其他影響，為本研究的不足之處。

本研究結果表明，人THP?1巨噬細胞樣細胞經酵母相刺激后激活p38MAPK信號通路并分泌IL?6，參與抗申克孢子絲菌固有免疫反應。

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Effects of the yeast form ofSporothrix schenckiion activation of p38MAPK and expression of interleukin?6 in human THP?1 macrophage?like cells

Liu Caixia,Du Leilei,Duan Zhimin,Zeng Rong,Shen Yongnian,Hu Suquan,Liu Weida,Chen Qing,Li Min

Department of Mycology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Liu CX,Du LL,Duan ZM,Zeng R,Shen YN,Hu SQ,Liu WD,Li M）;Research Laboratory,Jiangsu Province Blood Center,Nanjing 210042,China（Chen Q）

s:Li Min,Email:drlimin@sina.cn;Chen Qing,Email:qngchen@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate effects of the yeast form ofSporothrix schenckiion activation of p38 mitogen?activated protein kinase（p38MAPK）and expression of interleukin?6（IL?6）in macrophage?like THP?1 cells,which were differentiated from the human acute monocytic leukemia cell line THP?1.MethodsTHP?1 macrophage?like cells were divided into 3 groups to be treated with the yeast form ofSporothrix schenckiiat a concentration of 2 × 106colony?forming units（CFU）/ml（yeast form group）,100 mg/L curdlan（curdlan group） and RPMI 1640 medium （blank control group） respectively.Real?time fluorescence?based quantitative PCR was performed to measure the mRNA expression of IL?6 in THP?1 macrophage?like cells in the above 3 groups after 3?and 6?hour treatment separately,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to detect the level of IL?6 in the culture supernatant of THP?1 macrophage?like cells after 24?hour treatment.Western blot analysis was conducted to determine the protein expression of p38MAPK and phosphorylated p38MAPK（p?p38MAPK）in the above 3 groups after 30?and 60?minute treatment separately.Other THP?1 macrophage?like cells were pretreated with 100 nmol/L dexamethasone（a p38MAPK inhibitor）for 30 minutes,and then were divided into 3 groups to be treated with the yeast form ofSporothrix schenckii,curdlan and RPMI 1640 medium respectively,and changes in the level of p?p38MAPK and mRNA expression of IL?6 were also detected.Statistical analysis was carried out with SPSS19.0 software by using one?way or multi?way analysis of variance and least significant difference（LSD）test.ResultsSignificant differences in the mRNA expression of IL?6 in THP?1 macrophage?like cells were observed among the yeast form group,curdlan group and blank control group（F=5 552.22,P＜0.001）after 3?hour treatment（56.81 ± 7.36,26.69 ± 1.22 and 0.97 ± 0.05,respectively）and 6?hour treatment（378.03± 16.67,276.24 ± 39.13 and 1.02 ± 0.04,respectively）.Additionally,the yeast form group showed significantly higher mRNA expression of IL?6 after 6?hour treatment than that after 3?hour treatment（q=16.74,P＜ 0.001）.After 24?hour treatment,the level of IL?6 in the culture supernatant of THP?1 macrophage?like cells also significantly differed among the yeast form group,curdlan group and blank control group（59.96±18.16 pg/L,91.01±17.27 pg/L,5.50±2.30 pg/L,respectively;F=26.62,P＜ 0.01）,and was significantly higher in the yeast form group than in the blank control group（P＜ 0.01）.After 30?and 60?minute treatment,the protein expression of p?p38MAPK was significantly higher in the yeast form group than in the blank control group（bothP＜ 0.01）.Moreover,the mRNA expression of IL?6（4.46±1.03vs.493.52±113.87,P＜0.001）and protein expression of p?p38MAPK（2.29±0.37vs.4.55±0.46,q=10.81,P＜ 0.01）were both significantly lower in the yeast form group with dexamethasone pretreatment than in that without dexamethasone pretreatment.ConclusionIn vitrotreatment with the yeast form ofSporothrix schenckiican enhance the expression of IL?6 in human THP?1 macrophage?like cells by activating the p38MAPK signaling pathway.

Sporothrix;Macrophages;Interleukin?6;p38 Mitogen?activated protein kinases

李岷，Emal：drlimin@sina.cn；陳青，Email：qngchen@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.08.004

國家自然科學基金（81502739）；江蘇省自然科學基金（BK20150068）；北京協和醫學院協和青年基金（3332016108）；北京協和醫學院研究生創新基金（1002?01?18）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81502739）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20150068）;PUMC Youth Fund（3332016108）;PUMC Innovation Fund（1002?01?18）

2016?09?13）

（本文編輯：顏艷）