氧化應激下黑素細胞自噬相關基因差異表達分析

龔晴麗 李雪 丁高中 凌雨婷 趙文娥 熊喜喜 魯嚴

210029南京醫科大學第一附屬醫院皮膚科（龔晴麗、李雪、丁高中、凌雨婷、熊喜喜、魯嚴）；南京醫科大學分析測試中心（趙文娥）

·論著·

氧化應激下黑素細胞自噬相關基因差異表達分析

龔晴麗 李雪 丁高中 凌雨婷 趙文娥 熊喜喜 魯嚴

210029南京醫科大學第一附屬醫院皮膚科（龔晴麗、李雪、丁高中、凌雨婷、熊喜喜、魯嚴）；南京醫科大學分析測試中心（趙文娥）

目的探討過氧化氫（H2O2）對黑素細胞自噬的影響及可能的調節機制。方法取對數生長期健康人黑素細胞，分為空白對照組（不予任何處理）、陽性對照組（100 nmol/L西羅莫司處理）和實驗組（體積分數為10?7～10?3的H2O2處理），處理4 h后，使用CCK8法、流式細胞儀分別檢測各組黑素細胞活性及凋亡率。吖啶橙染色檢測自噬小泡，透射電鏡下觀察自噬小體，Western印跡檢測自噬特異性蛋白Beclin 1、微管相關蛋白輕鏈3B（LC3B）。最后采用包含84個自噬相關基因的RT2Profiler PCR Array篩選自噬相關的差異表達基因。結果黑素細胞分別經10?3、5 × 10?4、10?4、5 × 10?5、10?5、5 ×10?6、10?6H2O2處理后，細胞增殖活性及凋亡率與空白對照組相比差異均有統計學意義（F值分別為286.95、301.23，均P＜0.05），且隨H2O2體積分數升高，增殖活性降低，凋亡率升高。除5 × 10?6H2O2組分別與10?5、10?6H2O2組間相比細胞凋亡率差異無統計學意義外，上述各H2O2組間兩兩比較，黑素細胞增殖活性及凋亡率差異均有統計學意義（P＜0.05）。吖啶橙染色及電鏡觀察發現，10?5H2O2、10?6H2O2和西羅莫司處理的黑素細胞中有自噬小體形成。Western印跡顯示，10?5H2O2、10?6H2O2和西羅莫司組黑素細胞Beclin 1表達量和LC3B?Ⅱ/LC3B?Ⅰ比率均較空白對照組顯著升高（P＜0.05）。RT2 Profiler PCR Array結果顯示，與空白對照組相比，10?5H2O2組、10?6H2O2組和西羅莫司組中ATG12、ATG3、ULK1、PIK3CG、PTEN、PIK3C3表達均顯著上調，EIF2AK3表達顯著下調；10?5H2O2組和西羅莫司組mTOR表達顯著下調，ULK2表達顯著上調；10?6H2O2組mTOR表達未發生明顯改變,AMPK、JNK1表達顯著上調。結論體積分數為10?5和10?6的H2O2均能有效誘導黑素細胞自噬，可能與影響相關信號分子表達相關。

黑素細胞；自噬；過氧化氫；氧化性應激；寡核苷酸序列分析；細胞凋亡

Namazi等［1］提出“黑素細胞經表皮丟失”即：氧化應激下線粒體結構功能障礙與自噬能力降低是導致黑素細胞粘附功能降低及經表皮丟失的重要原因［2?4］。適量的自噬被認為是重要的細胞保護性反應［5］。如何調整氧化應激下黑素細胞的自噬水平從而起到保護細胞的作用，需要明確這一過程中黑素細胞自噬調節的分子機制。我們應用不同體積分數的過氧化氫（H2O2）模擬氧化應激環境，誘導黑素細胞發生自噬，采用PCR陣列技術（PCR array）篩選相關差異表達基因，探討氧化應激下黑素細胞自噬特有的調節方式。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

Ham F12培養基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（美國Gibco公司），G418、左旋多巴（L?DOPA）、西羅莫司（美國Sigma公司），山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗（上海碧云天生物技術有限公司），H2O2溶液（南京化學試劑有限公司），CCK8試劑盒（日本Dojindo公司），膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V?FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物技術有限公司），吖啶橙（美國Amresco生化試劑公司），鼠抗人Beclin 1抗體、兔抗人微管相關蛋白1輕鏈3B（LC3B）抗體、鼠抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（美國 Sigma公司），RT2Profiler PCR Array（德國Qiagen公司），128C型酶標儀（奧地利CliniBio公司），流式細胞儀（美國Beckman Coulter有限公司）。

二、黑素細胞培養及處理

標本來自南京醫科大學第一附屬醫院泌尿外科健康男性包皮環切術后的皮膚組織（已征得患者知情同意）。根據Swope等［6］的方法獲得單細胞懸液，接種于含常規黑素細胞培養基［7］的培養瓶中，置于5%CO2培養箱37℃孵育。24 h后換液去除未貼壁細胞，并加入G418，48 h后改用不含G418的培養基，當細胞融合至80%～90%時，用2.5 g/L胰酶消化傳代。L-多巴染色鑒定黑素細胞。

取對數生長期細胞，分為空白對照組（不予任何處理）、陽性對照組（100 nmol/L西羅莫司［8］處理）和實驗組［不同體積分數（10?3，5 × 10?4，10?4，5 × 10?5，10?5，5 × 10?6，10?6，5 × 10?7，10?7）H2O2處理］，處理 4 h后，檢測黑素細胞增殖活性及凋亡率，并篩選出體積分數為10?4、10?5和10?6的H2O2進行吖啶橙染色、電鏡觀察及Western印跡實驗。最后，根據上述實驗結果確定用體積分數為 10?5和10?6的 H2O2誘導后進行PCR array實驗，檢測自噬相關差異表達基因。

三、CCK8檢測H2O2處理后黑素細胞的增殖活性

向已處理好的96孔板中每孔加入100 μl培養基和10 μl CCK8溶液，孵育2 h后，使用酶標儀于450 nm波長處測定各孔的吸光度（A450值）。每組設4個平行孔，實驗重復3次取均值。

四、流式細胞儀檢測黑素細胞凋亡率

黑素細胞經不同體積分數H2O2處理后，胰酶消化，收集各組細胞，每組加入500 μl結合緩沖液、5 μl Annexin?FITC和5 μl PI混勻，室溫避光反應5 ～15 min，用流式細胞儀檢測凋亡率，將Annexin?FITC單標+Annexin?FITC和PI雙標細胞視為凋亡細胞。實驗重復3次。

五、吖啶橙染色檢測自噬小泡

取對數生長期細胞接種于小培養皿中，細胞處理同前，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，用4%多聚甲醛室溫下固定細胞10 min，再加入0.01%吖啶橙溶液，室溫避光孵育10～20 min后，PBS清洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察并攝片。

六、透射電鏡下觀察自噬小體

細胞處理同上，作用4 h后收集各組黑素細胞，加入4℃預冷的3%戊二醛，固定2 h以上，PBS洗滌3次，再加1%鋨酸固定2 h，PBS洗滌3次，經脫水后包埋、切片（厚度為80 nm），3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，置于透射電鏡下觀察自噬小體并攝片。

七、Western印跡檢測LC3B、Beclin 1蛋白表達

取對數生長期細胞，接種于直徑為10 cm的培養皿，細胞經上述處理后，提取各組細胞總蛋白，經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）電泳，轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，與Beclin 1、LC3B特異性抗體及相應二抗作用后，經化學發光法顯色。用Image J軟件分析圖片，計算LC3B、Beclin 1與GAPDH的灰度比值。

八、PCR array檢測自噬相關基因的差異表達

取對數生長期黑素細胞接種于T25細胞培養瓶，細胞經上述處理4 h后，按照試劑盒說明操作提取總RNA，反轉錄生成cDNA。實時PCR采用RT2Profiler PCR Array檢測自噬相關的84個基因，包含5種管家基因即次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶、β2微球蛋白、大核糖體蛋白、GAPDH和β肌動蛋白。計算循環數閾值（Ct），ΔCt=目的基因Ct-平均管家基因 Ct，ΔΔCt= 實驗組 ΔCt- 對照組 ΔCt，2?ΔΔCt值即為實驗組目的基因較對照組相應基因表達的倍數。

九、統計學處理

使用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。實驗數據均采用±s表示，各組間差異比較采用單因素方差分析法，各處理組與空白對照組比較采用LSD法，各處理組間兩兩比較采用SNK法，劑量效應采用Pearson相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。登陸網站http：//www.sabiosciences.com/dataanalysis.php在線分析PCR Array檢測結果，差異表達基因定義為2?ΔΔCt≥ 2的基因。

結 果

一、H2O2可降低黑素細胞的增殖活性

如表1所示，黑素細胞經10-7～10-3H2O2處理后，細胞增殖活性與空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），且隨H2O2體積分數升高而明顯下降（r=-0.979，P＜0.001）。100 nmol/L西羅莫司組黑素細胞增殖活性與空白對照組、5×10?7H2O2組和10?7H2O2組相比，差異均無統計學意義（P＞ 0.05），與其他各H2O2組相比差異均有統計學意義（P＜0.05）。除5 × 10?7H2O2與10?7H2O2組間差異無統計學意義（P=0.518）外，其他各H2O2組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

二、H2O2對黑素細胞凋亡的影響

分別經西羅莫司和H2O2處理4 h后，黑素細胞凋亡率與空白對照組相比差異均有統計學意義（P＜0.05），且隨H2O2體積分數升高而升高（r=0.950，P＜0.001）。西羅莫司組與除5 × 10?7H2O2組外的其他各H2O2組相比，黑素細胞凋亡率差異均有統計學意義（P＜0.05）。除5 × 10?7與10?7H2O2組間、5 × 10?6與10?5或10?6H2O2組間差異無統計學意義外（P＞0.05）外，其余各H2O2組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

三、吖啶橙染色檢測結果

10?4H2O2組吖啶橙染色未見紅色點狀熒光，西羅莫司、10?5H2O2、10?6H2O23組黑素細胞內紅色熒光強度明顯高于空白對照組。見圖1。

四、透射電鏡下觀察自噬小體

空白對照組黑素細胞內自噬小泡少見，細胞膜及核膜結構完整，線粒體及內質網結構正常。10?4H2O2處理組黑素細胞中線粒體腫脹，嵴排列紊亂，伴有內質網擴張，未見到自噬小泡。在西羅莫司、10?5H2O2、10?6H2O23個處理組中發現黑素細胞內自噬小泡明顯增多，并觀察到線粒體自噬，且線粒體損傷較10?4H2O2組輕，細胞核結構完整。見圖2。

表1 不同體積分數H2O2對黑素細胞增殖活性及凋亡的影響（±s）

表1 不同體積分數H2O2對黑素細胞增殖活性及凋亡的影響（±s）

注：n=3。a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與西羅莫司組比較，P＜0.05

組別空白對照組西羅莫司組H2O2組10?3 5 × 10?4 10?4 5 × 10?5 10?5 5 × 10?6 10?6 5 × 10?7 10?7 F值P值增殖活性（A450）0.958±0.041 0.927±0.041凋亡率（%）10.08±1.13b 15.20±1.05a 0.247±0.008ab 0.307±0.026ab 0.388±0.036ab 0.509±0.039ab 0.669±0.032ab 0.748±0.039ab 0.798±0.021ab 0.895±0.014a 0.909±0.022a 286.95＜0.05 61.74±1.63ab 53.72±2.30ab 43.76±3.32ab 34.51±3.43ab 22.03±1.47ab 20.85±1.20ab 18.04±3.05ab 12.71±0.58 12.01±1.02b 301.23＜0.05

圖1 倒置熒光顯微鏡下觀察自噬小泡（吖啶橙染色×200） 1A：空白對照組胞質中見少量紅色熒光；1B：10?4H2O2組細胞核及細胞質均呈黃綠色熒光，未見紅色熒光；1C～1E：分別為10?5H2O2組、10?6H2O2組、西羅莫司組，3組細胞胞質內可見斑點狀紅色熒光，熒光強度明顯高于空白對照組 圖2 透射電鏡下觀察自噬小體（黃色箭頭） 2A：空白對照組（×30 000）自噬小泡少見，細胞膜及核膜結構完整，線粒體及內質網結構正常；2B：10?4H2O2組（×30 000），線粒體腫脹、嵴排列紊亂，伴有內質網擴張，未見到自噬小泡；2C ～2E：分別為10?5H2O2組（× 30 000）、10?6H2O2組（× 20 000）、西羅莫司組（× 30 000），黑素細胞內自噬小泡明顯增多，可見線粒體自噬，且線粒體損傷較10?4H2O2處理組輕，細胞核結構完整

五、Beclin 1與LC3B?Ⅱ/LC3B?Ⅰ比率比較

黑素細胞經西羅莫司、10?5H2O2和10?6H2O2作用后，Beclin 1/GAPDH灰度比值分別為2.953±0.480、2.048±0.212和2.550±0.281，均顯著高于空白對照組（0.952 ± 0.110，均P＜0.05），而 10?4H2O2組（0.521±0.062）顯著低于空白對照組（P＜0.05）；LC3B?Ⅱ/LC3B?Ⅰ比率分別為6.088± 0.064、5.287 ±0.314和6.032±0.082，均顯著高于空白對照組（2.151 ± 0.106，均P＜0.05），而10?4H2O2組（2.396 ±0.144）與空白對照組相比差異無統計學意義（P=0.105），且西羅莫司組和 10?6H2O2組間差異無統計學意義（P=0.697）。見圖3。

六、差異表達的自噬相關基因

見表2。與空白對照組相比，各處理組的自噬相關基因12（ATG12）、自噬相關基因3（ATG3）、失調51樣激酶1（ULK1）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位γ（PIK3CG）、磷脂酰肌醇-3-激酶class 3（PIK3C3）、第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白的同源基因（PTEN）表達均顯著上調，真核生物翻譯起始因子-2α-激酶-3基因（EIF2AK3）表達顯著下調；10?5H2O2組和西羅莫司組哺乳動物西羅莫司靶蛋白（mTOR）基因顯著下調，失調51樣激酶2（ULK2）顯著上調；10?6H2O2組mTOR未發生明顯改變，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、c?Jun氨基末端激酶1（JNK1）顯著上調。

圖3 Western印跡檢測各處理組Beclin 1與LC3B表達 1：空白對照組；2：10?4H2O2組；3：10?5H2O2組；4：10?6H2O2組；5：西羅莫司組。LC3B：微管相關蛋白1輕鏈3B；GAPDH：3?磷酸甘油醛脫氫酶

表2 H2O2作用后黑素細胞與空白對照組相比差異表達的自噬相關基因（2?ΔΔCt）a

討 論

自噬與凋亡之間存在復雜的相互作用。在某些特定情況下，自噬能夠抵抗或延緩凋亡，利于細胞存活；但有些情況下又可與凋亡協作導致細胞死亡或在凋亡缺陷時作為后備機制誘導細胞死亡［9］。H2O2濃度、作用時間及作用的細胞類型不同，細胞可能發生自噬、自噬性死亡、凋亡或壞死等［10］。為了誘導氧化應激下黑素細胞發生自噬，我們首先檢測不同體積分數H2O2對黑素細胞增殖活性及凋亡的影響，結果顯示，與空白對照組黑素細胞相比，10?4～ 10?3H2O2處理的黑素細胞增殖活性明顯降低，且凋亡率顯著升高；而10?7、5 × 10?7H2O2組黑素細胞凋亡率與空白對照組相比差異無統計學意義，且5 × 10?6與 10?5H2O2組間及5 × 10?6與 10?6H2O2組間細胞凋亡率差異無統計學意義，僅 10?4、10?5、10?6H2O23組黑素細胞增殖活性及凋亡率與空白對照組相比及組間比較均存在統計學差異。所以，在后續自噬實驗中選擇了這3個濃度。而根據吖啶橙染色、透射電鏡及Western印跡實驗結果，在10?5及10?6H2O2這兩組觀察到黑素細胞發生自噬，故選擇這兩個濃度進行PCR array實驗。

自噬分子機制復雜，涉及30多個ATG基因、50個溶酶體水解酶及多條信號途徑［11］。目前已證實ULK1/2?ATG13?ATG17復合物的形成可啟動自噬，并受mTOR調控［12］。當mTOR被抑制時，ATG13去磷酸化并和ULK1/2?ATG17復合物結合，激活ULK1/2，引發自噬［13］。已知mTOR的上游受多條信號通路的調控，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號轉導通路是經典的調節自噬的mTOR上游信號途徑［14］。PTEN是一腫瘤抑制因子，對PI3K/AKT途徑進行負調節［15］，從而抑制mTOR激活，促進自噬發生。

本研究顯示，與空白對照組相比，10?5H2O2組和西羅莫司組PIK3CG、PTEN、ULK1、ULK2均顯著上調2倍以上，10?5H2O2組和西羅莫司組mTOR顯著下調，而10?6H2O2組mTOR無明顯改變。由此，我們推測10?5H2O2和西羅莫司可能主要通過PTEN負調節PIK3/AKT/mTOR依賴性途徑來促進自噬。而Ueno等［16］證明，在PTEN缺陷自噬受抑制的肝細胞中，西羅莫司并不能通過抑制mTOR來激發自噬，推測PTEN可通過mTOR非依賴性途徑調節自噬，10?6H2O2可能通過以上途徑誘導黑素細胞發生自噬。

Egan等［17］在線粒體自噬中觀察到，氧化應激作用下線粒體去極化能夠迅速減少細胞內ATP水平，激活AMPK，使其磷酸化，從而直接促進ULK1磷酸化，激活自噬。此外，在饑餓誘導的細胞自噬和心肌細胞自噬中觀察到，AMPK還可通過磷酸化JNK1，使凋亡相關蛋白BCL2發生多位點磷酸化，從而抑制BCL2?Beclin 1結合，Beclin 1得以解離，使得PIK3C3?BECN1多重復合物活性增加，從而促進自噬發生［18?20］。本研究顯示，與空白對照組相比，10?6H2O2組AMPK、JNK1顯著上調，BCL2與BECN1的上調倍數大于其他兩組；各組PIK3C3均顯著上調。由此推斷，10?6H2O2誘導的黑素細胞自噬可能通過上述途徑進行調節。此外，10?5H2O2、10?6H2O2和西羅莫司可能均直接刺激PIK3C3活性增加，促進自噬。

值得注意的是，EIF2AK3在10?5H2O2、10?6H2O2和西羅莫司組中均出現顯著下調，且下調倍數＞15。EIF2AK3參與內質網類似激酶?真核細胞翻譯啟始子2α（PERK?eIF2α）通路介導的內質網應激（ERS）［21］，近年研究發現，ERS途徑也是自噬的重要調控通路［22］。在ERS狀態下，EIF2AK3通過自身胞質側羧基端的蛋白激酶催化促進自身磷酸化，繼而使eIF2α蛋白51位絲氨酸磷酸化，導致蛋白合成受抑，減輕內質網負荷。EIF2AK3下調和EIF2AK3磷酸化水平增高是同時進行的，這也合理解釋了10?5H2O2、10?6H2O2組 EIF2AK3 基因較空白對照組顯著下調的結果。由此推測，ERS可能參與調控氧化應激誘導的黑素細胞自噬，通過EIF2AK3自身磷酸化來磷酸化eIF2α，進而上調ATG12并促進自噬。

綜上所述，10?5H2O2和10?6H2O2模擬的氧化應激條件均可誘導黑素細胞發生自噬，且不同濃度H2O2的誘導機制可能不僅涉及共同的調節通路，還涉及不同的調節方式。

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Differential expression of autophagy?related genes in melanocytes under oxidative stress

Gong Qingli,Li Xue,Ding Gaozhong,Ling Yuting,Zhao Wen′e,Xiong Xixi,Lu Yan
Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China（Gong QL,Li X,Ding GZ,Ling YT,Xiong XX,Lu Y）;Department of Analysis and Testing Center,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China（Zhao WE）

Lu Yan,Email:luyan6289@163.com

ObjectiveTo evaluate the effect of hydrogen peroxide（H2O2） on autophagy in melanocytes,and to explore its possible regulatory mechanisms.MethodsNormal human melanocytes at exponential growth phase were divided into several groups:blank control group receiving no treatment,positive control group treated with 100 nmol/L sirolimus solution,and experiment groups treated with H2O2solution at different volume fractions of 10?7-10?3respectively.After 4?hour treatment,cell counting kit?8（CCK?8）assay and flow cytometry were performed to evaluate the cellular proliferative activity and detect apoptosis of melanocytes respectively.Acridine orange staining was performed to detect autophagosome formation,transmission electron microscopy to observe ultrastructural changes of autophagosomes,and Western blot analysis to measure the expression of autophagy?specific protein Beclin 1 and microtubule?associated protein 1 light chain 3B（LC3B）.A total of 84 autophagy?related genes were analyzed by RT2Profiler PCR Array,so as to screen differentially expressed autophagy?related genes.ResultsAfter the treatment with H2O2at different volume fractions of 10?3,5 × 10?4,10?4,5 × 10?5,10?5,5 × 10?6and 10?6,experiment groups showed significantly decreased cellular proliferative activity,but significantly increased apoptosis rate compared with the blank control group（F=286.95,301.23,respectively,bothP＜ 0.05）.With the increase in volume fractions of H2O2,the cellular proliferative activity was significantly gradually decreased（P＜ 0.05）,while the apoptosis rate showed an opposite trend（P＜ 0.05）,except that the 5 ×10?6H2O2group showed no significant differences in the apoptosis rate compared with the 10?5H2O2group and 10?6H2O2group.Acridine orange staining and electron microscopy showed autophagosome formation in the 10?5H2O2group,10?6H2O2group and positive control group.Western blot analysis revealed that Beclin1 expression and LC3B?Ⅱ/LC3B?Ⅰ ratio were significantly higher in the 10?5H2O2group,10?6H2O2group and positive control group than in the blank control group（allP＜ 0.05）.RT2Profiler PCR Array showed significant up?regulation of ATG12,ATG3,ULK1,PIK3CG,PTEN and PIK3C3 genes and significant down?regulation of EIF2AK3 gene in the 10?5H2O2group,10?6H2O2group and positive control group compared with the blank control group.In the 10?5H2O2group and positive control group,the mTOR gene was significantly up?regulated,and the ULK2 gene was significantly down?regulated.The 10?6H2O2group showed no obvious changes in the expression of mTOR gene,but significant up?regulation of AMPK and JNK1 genes.ConclusionH2O2at volume fractions of 10?5and 10?6can induce autophagy in melanocytes,likely by influencing the expression of some related signaling molecules.

Melanocytes;Autophagy;Hydrogen peroxide;Oxidative stress;Oligonucleotide array sequence analysis;Apoptosis

魯嚴，Email：luyan6289@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.08.001

國家自然科學基金（81171517）；江蘇省“333工程”培養資金（BRA2013279）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81171517）;The“333”Project of Jiangsu Province（BRA2013279）

2016?07?12）

（本文編輯：尚淑賢）