溶栓顆粒對急性腦梗死大鼠海馬神經元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細胞因子水平的影響

桂 瑤 湯光花 陳永新 張瑞嶺

（1.湖北省武漢市紅十字會醫院，湖北 武漢430000；2.新鄉醫學院第二附屬醫院，河南 新鄉453002）

溶栓顆粒對急性腦梗死大鼠海馬神經元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細胞因子水平的影響

桂 瑤1湯光花2陳永新2張瑞嶺2

（1.湖北省武漢市紅十字會醫院，湖北 武漢430000；2.新鄉醫學院第二附屬醫院，河南 新鄉453002）

目的觀察溶栓顆粒對急性腦梗死大鼠海馬神經元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細胞因子水平的影響。方法將40只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組，每組10只，采用改良線栓法制作急性腦梗死大鼠模型。21 d后評價行為學改變，觀察大鼠海馬區神經元凋亡情況，免疫組化法檢測腦組織Caspase-3蛋白表達，ELISA法測定外周血腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-8（IL-8）水平。結果21 d后模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組行為學指標明顯低于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組明顯高于對照組 （P＜0.05）。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經元凋亡數和腦組織Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于對照組（P＜0.05）。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于對照組（P＜0.05）。結論溶栓顆粒可改善急性腦梗死大鼠模型的行為學指標，修復神經元細胞損傷，降低腦組織Caspase-3蛋白和外周血中細胞因子表達。

溶栓顆粒 急性腦梗死 神經元Caspase-3細胞因子

急性腦梗死是腦供血障礙造成腦細胞缺血缺氧發生壞死，導致系列神經癥狀，發病率高、致死率高，可由顱腦損傷、頸內動脈血血栓脫落、手術血栓等引起，嚴重威脅人體健康。急性腦梗死發病復雜，可能與大腦神經遞質減少導致心理和精神活動低下有關，可能與激素異常導致炎癥細胞因子升高等有關[1-3]。急性腦梗死治療多采用抗血小板聚集、神經保護等綜合，易引起多種副作用，臨床應用受到限制[4]。中醫學認為急性腦梗死是由氣機郁滯、氣虛血瘀導致，病因為情志內傷，病機為憂思郁怒，肝氣郁結，治宜理氣開郁，調暢氣機為主[5]。溶栓顆粒具有升降并舉、氣血同調、痰瘀并治、標本兼顧，治療急性腦梗死有較好的臨床療效，但其機制不清[6]。本研究通過建立急性腦梗死模型大鼠，研究溶栓顆粒對急性腦梗死模型大鼠海馬神經元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細胞因子水平的影響，探討溶栓顆粒治療作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠，雄性，體質量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。在（23±2）℃環境中采用12 h晝夜節律飼養，研究過程中自由飲水進食，白天（9：00～17：00）進行試驗研究。

1.2 藥物與試劑 溶栓顆粒（新鄉醫學院第二附屬醫院制劑室）；丁苯酞 （美國禮來公司，生產批號L01984）；羧甲基纖維素鈉和Caspase-3試劑盒購于英國Abcam公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）和白介素-8（IL-8）試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；TUNEL凋亡試劑盒和DAB顯色試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；PBS緩沖液和二抗購于寶生物工程有限公司；其他試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.3 實驗儀器LDZ-2型低速離心機（北京京立離心機有限公司）；WGY-10型分光光度計 （天津光學儀器有限公司）；Mini-PROTEAN3電泳、ELx800酶標儀及Mini-PROTEAN3電轉移系統 （美國伯騰儀器有限公司）；電子天平（瑞士梅特勒公司）；超低溫冰箱（合肥美菱股份有限公司）；倒置x51顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）。

1.4 造模與分組 自由飲食適應性喂養7 d后，選擇敞箱實驗評分相近的40只大鼠隨機分為對照組、模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組，每組10只。對照組正常飼養。將模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組大鼠，水合氯醛麻醉，俯臥固定于手術臺，采用改良線栓法制作急性腦梗死大鼠模型。模型組自由飲水進食，溶栓顆粒組第2日開始灌服溶栓顆粒，劑量200 mg/kg，丁苯酞組第2日開始灌服丁苯酞，劑量0.28mL/kg，溶栓顆粒組和丁苯酞組每日灌胃1次，連續20 d。

1.5 標本采集與檢測1）行為學評價。21 d后采用敞箱實驗評價各組大鼠的行為學。在80 cm×80 cm×40 cm四壁涂黑的正方形紙板箱底面畫25cm正方形，將大鼠放入箱底，安靜狀態下記錄3 min內大鼠在正方形紙板箱的水平次數、直立次數和修飾次數。然后對大鼠進行糖水消耗實驗，大鼠給予純水和1%蔗糖水，記錄24 h的消耗量。糖水偏愛度=1%蔗糖水量/總水量×100%。2）神經元檢測。行為學測試完畢后，眼球取血處死動物。在4℃迅速取腦，生理鹽水清洗后，冰凍切片，選取海馬組織切片，PBS洗滌3次，貼片，晾干，二甲苯脫脂，酒精脫水，焦油紫染色，水清洗，鹽酸-酒精分色，酒精脫水后中性樹膠封片。切片脫蠟脫水，蛋白酶K消化，PBS清洗，滴加TUNEL試劑盒反應液和復合液，DAB顯色，蘇木素復染并封片。顯微鏡下隨意取5個視野，觀察海馬神經元形態改變和海馬區棕褐色凋亡細胞數。3）Caspase-3蛋白分析。眼球取血處死動物后取腦組織，凍存管分裝，液氮保存。解凍后研磨腦組織，加入預冷的蛋白裂解液，4℃條件下10000 r/min離心20 min，取上清，采用蛋白質定量試劑盒測定總蛋白。采用SDS-PAGE電泳分離腦組織總蛋白，電轉移至PVDF膜上，PBS液洗10 min。蛋白封閉后，GAPDH為內參，加入Caspase-3一抗和二抗，以1∶1000偶聯辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG孵育30 min，暗室曝光、顯影、晾干，凝膠圖像處理軟件分析光密度值。4）細胞因子檢測。21 d處死實驗動物，采集外周血，3000 r/min離心15min，分離血清后-80℃保存。采用ELISA法測定外周血TNF-α、IL-2和IL-8細胞因子水平，嚴格按照試劑說明書操作。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗比較組內和組間差異，計數資料以n（%）表示，應用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學評價結果比較 見表1。21 d后模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組行為學指標明顯低于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組明顯高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。但溶栓顆粒組和丁苯酞組行為學指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠海馬神經元凋亡數和腦組織Caspase-3蛋白比較 見表2，圖1。對照組海馬神經元細胞排列規則，細胞豐富，神經元胞膜完整，胞核形態正常；模型組海馬神經元細胞排列不規則，細胞減少，細胞紊亂變稀，神經元胞膜破裂，細胞脫落形成空泡；溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經元細胞排列較規則，細胞較豐富，神經元胞膜較完整，部分細胞萎縮、核變小，有部分空泡。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經元凋亡數明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于模型組（P＜0.05）。溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經元凋亡數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組腦組織Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于模型組 （P＜0.05），但溶栓顆粒組和丁苯酞組腦組織Caspase-3蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠行為學評價結果比較（±s）

表1 各組大鼠行為學評價結果比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別n 水平得分（分）垂直得分（分）修飾次數（分）糖水偏愛度（%）對照組10模型組10溶栓顆粒組10 14.61±1.23 85.26±7.24 6.39±1.02 81.56±6.23 7.25±0.96*35.17±5.62*1.53±0.96*36.72±5.13*12.34±1.32*△73.41±6.89*△3.72±1.12*△70.15±5.67*△丁苯酞組1012.51±1.38*△74.10±7.05*△4.06±1.22*△71.03±5.18*△

表2 各組大鼠海馬神經元凋亡數和腦組織Caspase-3蛋白比較（±s）

表2 各組大鼠海馬神經元凋亡數和腦組織Caspase-3蛋白比較（±s）

組 別n 神經元凋亡數（個）Caspase-3蛋白光密度值（OD）對照組10模型組10溶栓顆粒組10 12.34±2.67 0.76±0.11 61.27±6.81*2.34±0.15*31.51±5.47*△1.51±0.12*△丁苯酞組1032.64±5.31*△1.48±0.13*△

圖1 各組大鼠海馬神經元形態結構（DAB-蘇木素，400倍）

2.3 各組大鼠外周血中細胞因子水平比較 見表3。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于模型組（P＜0.05）。但溶栓顆粒組和丁苯酞組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠外周血中細胞因子水平比較（ng/mL，±s）

表3 各組大鼠外周血中細胞因子水平比較（ng/mL，±s）

組 別n TNF-αIL-2 IL-8對照組10模型組10溶栓顆粒組10 32.17±4.71 3.42±0.16 1.83±0.11 61.42±6.27*5.73±0.39*4.57±0.27*46.38±5.33*△4.41±0.25*△3.24±0.15*△丁苯酞組1045.26±5.41*△4.26±0.23*△3.13±0.12*△

3 討 論

急性腦梗死發病機制復雜，可能與單胺類神經遞質、甲腎上腺素、膽堿能-去甲腎上腺素等有關，大腦神經遞質在神經突觸間濃度減少，導致心理功能和精神活動低下，海馬神經元凋亡是神經退行性病變的主要病理基礎[7]。 近年來發現外周血TNF-α、IL-2等細胞因子與急性腦梗死密切關系[8]。急性腦梗死屬中醫郁病范疇。郁病主要由七情所傷、情志不遂，或郁怒傷肝、肝郁氣滯而發病，病位在肝。因此，治郁之要，在于氣血同調、痰瘀并治[9-10]。溶栓顆粒由枳實、柴胡、川芍、地龍、澤蘭、水蛙、丹參組成，具有疏肝解郁、調理氣血之功，治療郁病具有較好的臨床療效，但其作用機制尚不清楚。本研究通過分析其對急性腦梗死大鼠模型的行為學、海馬神經元凋亡、腦組織Caspase-3蛋白及外周血中細胞因子水平，探討溶栓顆粒治療急性腦梗死的機制，為其臨床應用提供依據。

本研究發現，21 d后模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組行為學指標明顯低于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組明顯高于對照組，說明溶栓顆粒治療急性腦梗死具有較好的療效。模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組海馬神經元凋亡數和腦組織Caspase-3蛋白表達明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于對照組。說明溶栓顆粒可修復神經元細胞損傷，降低腦組織Caspase-3蛋白表達，可能是由于溶栓顆粒方中枳實和柴胡為君藥，疏肝解郁，調達肝氣；川芍、丹參共為臣藥，行氣活血之功，助君藥調理氣血；水蛭、地龍、澤蘭為佐藥，活血破血，熄風通絡配主藥以利氣血的暢通；諸藥相配，升降并舉、氣血同調、痰疲并治、標本兼顧。具有疏肝解郁、調理氣血之功效[11-12]。柴胡皂苷通過激活凋亡途徑上游蛋白Caspase-9，激活下游凋亡蛋白Caspase-3，產生促進細胞凋亡作用[13]。梔子恢復海馬的結構與功能。同時本研究發現，模型組、溶栓顆粒組和丁苯酞組外周血TNF-α、IL-2和IL-8水平明顯高于對照組，而溶栓顆粒組和丁苯酞組低于對照組，說明溶栓顆粒可降低外周血中細胞因子表達。這與柴胡疏肝解郁，抑制海馬區細胞形態和活性，減少海馬區神經細胞凋亡，丹參活血化瘀，減少外周血TNF-α、IL-2和IL-8的產生有關[14-15]。

綜上所述，急性腦梗死模型大鼠的海馬神經元損傷嚴重，產生大量神經元凋亡，腦組織Caspase-3蛋白升高，增加外周血中細胞因子，溶栓顆粒可改善急性腦梗死模型大鼠的行為學指標，修復神經元細胞損傷，降低腦組織Caspase-3蛋白和外周血中細胞因子表達。

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R285.5

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1004-745X（2017）10-1766-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.025

2017-03-05）