骨內單次注射辛伐他汀促進小鼠乳腺癌腫瘤血管正常化的研究

海 寶，劉 燦，張 穩(wěn)，祝俊雄，曹寶山，宋純理,2

(1.北京大學第三醫(yī)院骨科，北京 100191；2.脊柱疾病研究北京市重點實驗室，北京 100191；3.北京大學第三醫(yī)院腫瘤化療與放射病科，北京 100191)

研究報告

骨內單次注射辛伐他汀促進小鼠乳腺癌腫瘤血管正常化的研究

海 寶1，劉 燦1，張 穩(wěn)1，祝俊雄1，曹寶山3，宋純理1,2*

(1.北京大學第三醫(yī)院骨科，北京 100191；2.脊柱疾病研究北京市重點實驗室，北京 100191；3.北京大學第三醫(yī)院腫瘤化療與放射病科，北京 100191)

目的研究骨內單次注射辛伐他汀對小鼠乳腺癌腫瘤血管結構和功能的影響。方法構建小鼠乳腺癌原位模型，分別給予骨內單次注射辛伐他汀(50 μg)或空白載體。α-SMA/CD31免疫熒光雙染觀察腫瘤血管的周細胞/血管內皮細胞覆蓋率；尾靜脈注射伊文氏藍染料觀察腫瘤血管滲透性；免疫組化檢測腫瘤內部HIF-1α表達水平的變化。結果免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)與對照組相比辛伐他汀組腫瘤血管周細胞覆蓋增多(P< 0.05)；腫瘤組織內伊文氏藍含量顯著降低(P< 0.05)，提示腫瘤血管滲透性減低，腫瘤血管趨于成熟；免疫組化顯示腫瘤內部HIF-1α的表達水平降低，乳腺癌腫瘤組織缺氧改善。結論骨內單次注射辛伐他汀能夠提高新生血管的周細胞覆蓋，促進乳腺癌腫瘤血管正常化。

辛伐他汀；骨內注射；血管正常化；乳腺癌；周細胞

腫瘤的生長和轉移依賴新血管的形成[1]，而新生的腫瘤血管往往結構異常并且雜亂無章，大約有50%的腫瘤血管都是無功能的，形成組織間隙壓升高、局部低氧的腫瘤微環(huán)境[2]。有學者提出通過抗腫瘤血管新生以達到“餓死腫瘤”的目標，但目前此方面的研究并未取得應有的治療效果，甚至因血管阻斷藥物造成局部缺氧，反而加速新血管生成和腫瘤生長[3]。近年來，腫瘤“血管正常化”作為一種新的治療理念，被廣泛研究[4,5]，合理應用抗血管生成藥物可以使異常的腫瘤新生血管趨于正常化，通過與化療藥物結合治療能夠增強藥效，但其治療時間窗口很窄，難以廣泛應用[6]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有除降脂以外的“多效性”，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤等[7]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)骨內單次注射辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠具有動員內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)促進局部成骨及成血管的作用[8]。新的觀點認為，骨骼不僅是參與運動和支撐作用的惰性器官，而且是能夠分泌多種活性物質的“內分泌器官”[9]，骨重建過程中，釋放大量的促血管生成因子如VEGF、bFGF等影響系統(tǒng)血管新生[10]。骨髓內還儲存著豐富的EPCs和周細胞等[11]，研究表明骨髓源性的造血干細胞能夠分化為EPCs被動員至腫瘤參與血管的新生，而骨髓來源的周細胞也能夠被募集至腫瘤促進血管的成熟[12]。

本實驗通過骨內單次注射辛伐他汀水凝膠，觀察其作用于骨髓內而產生的對遠處腫瘤血管形態(tài)和功能的影響，為腫瘤的治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠40只，6周齡，體重18～20 g，購買于北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部[SCXK(京)2016-0010]，飼養(yǎng)于北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部[SYXK(京)2016-0041]，實驗動物單籠飼養(yǎng)，自由飲食，并按照實驗動物使用的“3R”原則給予人道關懷，適應性喂養(yǎng)一周后開始實驗。

1.1.2 細胞株

4T1小鼠乳腺癌細胞株由德國伯托公司惠贈。

1.2主要試劑與儀器

辛伐他汀原料藥(中國藥品生物制品檢定所)；泊洛沙姆(德國BASF公司)；兔抗(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；抗CD31多克隆抗體(Abcam，美國)；抗α-SMA單克隆抗體(Abcam，美國)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；倒置熒光顯微鏡(Leica，德國)。

1.3實驗方法

1.3.1 建立4T1乳腺癌細胞株小鼠移植瘤模型

取對數(shù)生長期的4T1小鼠乳腺癌細胞接種于小鼠乳腺脂肪墊。監(jiān)測小鼠的一般情況、體重、飲食及排便狀況，使用游標卡尺隔日記錄小鼠皮下腫塊體積。以腫瘤最長直徑(a)和垂直最短徑(b)計算腫瘤體積分數(shù)：公式V(mm3)= ab2/2(V為腫瘤近似體積)[13]。

1.3.2 泊洛沙姆水凝膠配制

泊洛沙姆407的配制按照本實驗室既往方法[14]，將辛伐他汀粉末加入配制好的泊洛沙姆溶液中，攪拌均勻，最終濃度為2.5 mg/mL。

1.3.3 藥物干預及分組

待腫瘤達到100 mm3時開始進行藥物干預，將荷瘤小鼠按完全隨機數(shù)表隨機分為兩組：空白對照組(control)、辛伐他汀組(SIM)，每組20只。異氟烷麻醉，使用微量注射器在小鼠脛骨上端穿刺，注射50 μg辛伐他汀水凝膠，觀察腫瘤組織缺氧的變化與腫瘤血管形態(tài)的改變。

1.3.4 伊文氏藍(Evans blue)染色檢測腫瘤血管滲透性

小鼠采用戊巴比妥鈉麻醉后，尾靜脈注射2%的伊文氏藍染料100 μL，循環(huán)20 min。取材，瘤體置于60℃條件下烤干16 h。然后將瘤體放入含1 mL的甲酰胺溶液的EP管中，在室溫下浸泡72 h以提取染料。采用酶標儀在630 nm波長下分別測定各瘤體染料含量。

1.3.5 免疫熒光雙染觀察血管周細胞

將小鼠組織標本取材后，分別放入4%多聚甲醛和液氮中保存，OCT包埋，使用冰凍切片機將腫瘤組織切片，7 μm厚，0.2%Triton-100冰上破膜，1%正常山羊血清封閉1 h，切片上同時滴加兩種一抗：兔抗CD31多克隆抗體(1∶200)和Cy3標記的鼠抗α-SMA單克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過夜，加DyLight-488羊抗兔二抗(1∶500)室溫避光孵育1 h，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件統(tǒng)計分析，計算α-SMA+/CD31+周細胞覆蓋率。

1.3.6 免疫組化檢測HIF-1α的表達

將甲醛固定的標本石蠟包埋，切片，5 μm厚，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，封閉，加兔抗HIF-1α多克隆抗體(1∶100)4℃孵育過夜，次日加羊抗兔二抗在室溫下孵育30 min，加入DAB顯色液，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.7 HE染色觀察腫瘤壞死面積

將石蠟切片，經過二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，使用蘇木素染色，用含有1%鹽酸的酒精進行分色，脫去殘余的染料，加入1%的伊紅染液，梯度酒精分色及脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，Image J軟件統(tǒng)計分析，計算腫瘤的壞死面積。

1.4統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1骨內單次注射辛伐他汀降低乳腺癌腫瘤組織血管滲透性

伊文氏藍灌注法檢測血管滲透性，結果顯示空白對照組染料外滲至腫瘤間質的量為(0.58±0.38) μg/g，而辛伐他汀組伊文氏藍染料的外滲量為(0.26±0.31)μg/g，腫瘤血管中染料的外滲量明顯減少(圖1)，差異有顯著性(P< 0.05)，說明骨內注射辛伐他汀能夠降低腫瘤血管的滲透性。

注：與Control組比較，* P < 0.05。圖1 腫瘤間質的伊文氏藍滲透量Note. Compared with control group,* P < 0.05.Fig.1 Interstitial infiltration of Evans blue

2.2骨內注射單次辛伐他汀促進乳腺癌血管結構成熟

免疫熒光染色分別標記代表血管內皮細胞的CD31和代表血管壁周細胞的α-SMA，觀察骨內單次注射辛伐他汀后腫瘤血管周細胞的覆蓋情況。血管周細胞覆蓋率是指周細胞(α-SMA+)表達的血管占所有血管(CD31+)的百分比。觀察發(fā)現(xiàn)α-SMA+在辛伐他汀組(SIM)與空白對照組(control)相比明顯增多，使用Image J軟件分析發(fā)現(xiàn)α-SMA+/CD31+比率明顯上升(圖2)，表明腫瘤血管的周細胞覆蓋明顯增多。

注：A：免疫熒光圖；B：統(tǒng)計學分析。與Control 比較，* P < 0.05。圖2 腫瘤血管α-SMA+/CD31+免疫熒光雙染及統(tǒng)計結果Note.A: Immunofluorescence staining; B: Quantifications of α-SMA+.Compared with control group, * P < 0.05.Fig.2 Co-immunofluorescence stain with CD31 and α-SMA of tumor vessels

2.3骨內單次注射辛伐他汀改善乳腺癌腫瘤組織缺氧

采用免疫組化對小鼠乳腺癌組織切片進行HIF-1α染色，用來評價腫瘤組織內部的缺氧程度，結果顯示HIF-1α陽性細胞數(shù)量在辛伐他汀組與對照組相比顯著降低(圖3)。說明腫瘤內部的缺氧情況經過骨內注射辛伐他汀的作用得到改善，其作用機制可能與腫瘤新生血管的正常化有關。

圖3 腫瘤組織HIF-1α免疫組化染色Fig.3 Immunohistochemical staining of HIF-1α in the tumor tissue

注：A：HE染色；B：統(tǒng)計學分析。與Control 比較，* P < 0.05。圖4 腫瘤組織壞死面積HE染色及分析Note.A: HE staining; B: Quantifications of tumor necrosis area. Compared with the control group, * P < 0.05.Fig.4 HE staining and analysis of tumor necrosis area

2.4骨內單次注射辛伐他汀減少乳腺癌腫瘤壞死面積

通過對腫瘤組織做HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀組的腫瘤壞死面積與對照組相比明顯減少，差異有顯著性(圖4)。

3 討論

傳統(tǒng)抗血管治療方法旨在阻斷腫瘤血管的生成，通過使用血管抑制劑破壞腫瘤血管的生長，期待能夠減少腫瘤的血液供應，造成腫瘤組織的缺血缺氧從而“餓死”腫瘤細胞[15]。然而，血管抑制劑的過度應用使腫瘤血管嚴重退化，阻礙藥物和氧份的輸送而拮抗化療和放療的效果，并導致腫瘤細胞對缺氧環(huán)境的耐受，促使腫瘤細胞分泌血管生長因子進入腫瘤微環(huán)境，導致腫瘤進一步惡化[3]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，合理應用抗血管生成藥物能夠在短期內使腫瘤血管“正常化”，并且能夠促進化療藥物的敏感性[16]。Jain[17]提出抗血管生成藥物的合理應用，能夠在血管消退之前修復“不正常”的腫瘤血管，使更有效的運輸氧和藥物到達腫瘤內部，從而提高放化療的敏感性。盡管如此，目前用于促進“血管正常化”研究的藥物大多是抗血管生成劑[18,19]，而抗血管生成的藥物很難精確控制其劑量，過多或過少都會影響其效果，并且伴隨著許多副作用[20,21]。

辛伐他汀作為HMG-CoA還原酶抑制劑，是甲羥戊酸通路中的一種限速酶。甲羥戊酸通路影響著體內合成多種生化分子的過程，包括合成膽固醇和類異戊二烯等，因此他汀類藥物的體內應用顯示出其降脂以外的“多效性作用”[22]。

體外研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀降低MDA-MB231和BT-20乳腺癌細胞的遷移能力[23]。可通過甲羥戊酸途徑誘導PI3K/Akt和MAPK/ERK信號傳導的失活，從而誘導乳腺癌細胞死亡[24]。不同劑量的他汀能夠產生不同的療效，低劑量促進血管生成，高劑量抑制血管生成[25]。有研究表明，低劑量辛伐他汀能夠上調eNOS表達，促進周細胞的募集；高劑量辛伐他汀通過抑制ROS介導的VEGF的表達，達到抑制血管生成、降低腫瘤血管滲透性的作用[13]。但系統(tǒng)應用他汀類藥物生物利用度低，口服后不到5%的藥物能夠進入血液循環(huán)[26]，想要發(fā)揮作用需要服用過高的劑量。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，骨內單次注射辛伐他汀，能夠通過上調VEGF和BMP2的表達促進骨和血管生成[8]。作用機制主要是辛伐他汀能夠動員骨髓內的EPCs進入外周血，達到組織缺血的部位參與血管的形成。

本課題組通過建立4T1小鼠乳腺癌模型，研究發(fā)現(xiàn)骨內單次注射辛伐他汀促進代表腫瘤血管周細胞的α-SMA表達增多，提示腫瘤血管的完整性增加。血管的穩(wěn)定主要依賴內皮細胞和周細胞，而有研究表明周細胞來源于骨髓[11]，因此我們推測骨內注射辛伐他汀是通過動員骨髓內的周細胞到達腫瘤血管，從而促進腫瘤血管正常化。

腫瘤血管正常化的另一項觀察指標是血管的滲透性，成熟的血管滲透性降低[27]，我們使用伊文氏藍灌注發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀組的腫瘤滲透性明顯降低。血管滲透的減少能夠使得輸送更多的氧氣和化療藥物到達腫瘤中心，減輕腫瘤的缺血缺氧狀況。HIF-1α在缺氧介導的細胞凋亡和腫瘤增殖中具有至關重要的作用，能夠通過對多種腫瘤靶基因的調控促進侵襲和轉移能力[28]，它受細胞內部的氧分壓精細調節(jié)，在缺氧條件下，HIF-1α的誘導速度加快，而其降解過程受阻，表達水平迅速升高，是反應腫瘤缺氧狀況的重要標志[29]。我們使用免疫組化對腫瘤組織染色發(fā)現(xiàn)，通過骨內注射辛伐他汀，腫瘤組織中HIF-1α的表達明顯減少，差異有顯著性(P< 0.05)，提示腫瘤內部缺氧得到改善。腫瘤血管正常化使得腫瘤間質液壓降低，化療藥物更容易到達腫瘤組織發(fā)揮作用，從而與化療藥物產生協(xié)同作用。通過腫瘤內血流的改善，使更多的化療藥物進行有效的灌注[30]，或將為腫瘤的化療提供新的治療策略，這也是未來重點研究的方向。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，通過骨內單次注射小劑量辛伐他汀，促進小鼠乳腺癌腫瘤血管正常化，改善腫瘤局部缺氧。

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Studyontheeffectofsingledoseintraosseousinjectionofsimvastatinontumorvascularnormalizationinmurinebreastcancer

HAI Bao1, LIU Can1, ZHANG Wen1, ZHU Jun-xiong1, CAO Bao-shan3, SONG Chun-li1,2*

(1.Department of Orthopedics, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China; 2.Beijing Key Laboratory of Spinal Diseases, Beijing 100191; 3.Department of Cancer Chemotherapy and Radiology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191)

ObjectiveTo investigate the effect of single dose intraosseous injection of simvastatin on tumor vascular structure and function in murine breast cancer.MethodsBALB/c mice and 4T1 murine breast cancer cells were used to establish a subcutaneous xenograft model. The mouse model of orthotopic breast cancer

intraosseous injection of a single dose of simvastatin (50 μg) or vehicle only. Frozen tumor tissue sections were prepared for co-immunostained with CD31 and α-SMA. Evans blue dye was injected into the tail vein to observe the vascular permeability. The expression level of HIF-1α was detected by immunohistochemistry.ResultsImmunofluorescence dual staining showed that intraosseous injection of simvastatin increased the number of perivascular pericytes in the tumor vessel(P< 0.05), Evans blue dye content showed that in vivo vessel permeability in the tumor tissue was significantly decreased(P< 0.05),and the immunohistochemistry results showed that local hypoxic area was significantly improved.ConclusionsSingle dose intraosseous injection of simvastatin can promote the normalization of tumor vasculature by improving the coverage of pericytes.

Simvastatin; Intraosseous injection; Vasculature normalization; Breast cancer; Pericyte

R-33

A

1671-7856(2017)010-0001-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.010.001

2017-04-25

國家自然科學基金項目(81672133,81641079)；國家高技術研究發(fā)展計劃(2015AA020304)。

海寶(1989-)，男，碩士生，專業(yè)：外科學。E-mail: haibao@bjmu.edu.cn

宋純理(1971-)，男，研究員，研究方向：骨質疏松、骨折愈合。E-mail: schl@bjmu.edu.cn