1α,25(OH)2D3對大鼠關節軟骨細胞潤滑素表達的影響

牛國棟，李思維，劉忠軍，宋純理，冷慧杰

(北京大學第三醫院骨科，北京 100191)

研究報告

1α,25(OH)2D3對大鼠關節軟骨細胞潤滑素表達的影響

牛國棟，李思維，劉忠軍，宋純理，冷慧杰*

(北京大學第三醫院骨科，北京 100191)

目的在細胞水平，探討1α,25(OH)2D3對軟骨細胞潤滑素合成和分泌的影響。方法使用炎性因子TNF-α對大鼠關節軟骨細胞進行炎癥干預，分別添加不同劑量1α,25(OH)2D3至正常及炎癥狀態下的軟骨細胞，使用ELISA及Western Blot方法分別檢測細胞上清中和細胞內潤滑素分泌表達的變化，從而評估1α,25(OH)2D3對大鼠關節軟骨細胞潤滑素的調節作用。結果TNF-α可以明顯降低細胞活性，以及細胞內和細胞上清液中潤滑素的表達分泌。1α,25(OH)2D3可以升高正常軟骨細胞以及炎癥狀態下軟骨細胞的活性，但是不能調節正常軟骨細胞上清和胞內潤滑素的分泌和表達。對于炎癥狀態的軟骨細胞，1α,25(OH)2D3可以明顯提高潤滑素在細胞上清及細胞內的分泌表達，并有一定劑量依賴性。結論1α,25(OH)2D3能夠促進炎癥狀態下的軟骨細胞潤滑素的表達分泌，從而更好的保護軟骨表面。

1α,25(OH)2D3；潤滑素；軟骨細胞；關節炎

骨性關節炎是常見多發病，因其病程長，且致病因素復雜，包括遺傳因素，年齡因素，創傷后力學因素等，從某種意義來說，也是疑難病[1-3]。其中關節損傷導致的關節不穩定從而造成關節軟骨表面過度的摩擦負荷，是軟骨損傷的重要原因。關節軟骨作為一種非常復雜的摩擦學系統，可在關節的各種運動情況下提供極低的摩擦，從而防止關節軟骨的磨損[4]。關節的最佳功能狀態與關節的低摩擦系數環境的維持是分不開的[5]。

關節腔中充填著軟骨細胞和滑膜細胞分泌的關節滑液。在對關節軟骨表層的保護中，關節腔中的滑液起著很重要的作用。關節滑液中的主要潤滑成分包括透明質酸、潤滑素以及表面活性磷脂。透明質酸作為滑液的主要成分(3.5mg/dL)，早已引起廣泛關注，而潤滑素是近年才引起了學者們的關注。最近的研究表明，透明質酸、潤滑素和表面活性磷脂三者必須協同起潤滑作用、缺一不可[6]。潤滑素作為關節軟骨表面邊界潤滑的最重要蛋白，主要由關節軟骨最表面的軟骨細胞和關節囊內表面的滑膜細胞所分泌，作為關節軟骨表面的邊界潤滑劑和細胞保護劑，在維持關節結構與功能上起著重要的作用[7]。潤滑素不僅在邊界潤滑中發揮著重要的物理性保護作用，還具有抗炎癥，抗滑膜組織增生等生物性保護作用[8]。已經有研究建議將潤滑素作為治療骨性關節炎的一個重要策略[9]。

維生素D(VD)是一種類激素的營養物質，在人體中發揮的作用非常復雜，是目前的研究熱點[10]。人們對于VD對于骨骼的重要生理作用已經非常明確，其缺乏會導致多種骨骼疾病，如佝僂病、骨質疏松、軟骨病等[11, 12]。但VD水平與骨性關節炎的發生發展之間的關系尚存爭議[13-16]。很多學者都在此領域進行探索。首先，已經有研究證實了軟骨細胞中VD受體的表達[19]。并且，近來很多研究結果肯定了VD對關節軟骨的保護作用[15, 17, 18]。VD對于關節軟骨的具體保護作用機制可能并不單一。目前文獻中還沒有研究探討VD對潤滑素的調節作用，而這對更全面認識VD在關節生理代謝中所起的作用有重要意義。我們的前期實驗研究表明，VD可以通過TGF-β1調節關節軟骨Ⅱ型膠原的表達和降解[20]。而有實驗證明，TGF-β在潤滑素表達分泌的過程中起著非常重要的作用[5, 21, 22]。因此我們假設維生素D可能可以通過調節關節軟骨潤滑素的分泌來保護軟骨。本研究在細胞水平上探索維生素D是否可以促進關節軟骨細胞潤滑素的表達，進一步理解維生素D保護關節軟骨的潛在機制。

1 材料和方法

1.1實驗材料

實驗所用的軟骨細胞取自5只出生后24 h內的SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠，由北京大學醫學部實驗動物中心提供[SYXK(京)2016-0041]。

1.2試劑

75%乙醇(北京化工廠)；1α,25(OH)2D3(Selleck，美國)；雙抗(Gibco，美國)；PBS(Hyclone，中國)；胎牛血清(Gibco，美國)；DMEM低糖培養基(Hyclone，中國)；Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國)；甲苯胺藍試劑(索萊寶公司，中國)；4%多聚甲醛(索萊寶公司，中國)；TritonX-100試劑(Sigma，美國)；5%BSA試劑(中杉金橋公司，中國)；CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)；Ⅱ型膠原抗體(Biosis，美國)；Lubricin Elisa試劑盒(HCB，加拿大)；酶標儀(Thermo，美國)；抗Lubricin抗體(Santa Cruz，美國)；抗GAPDH抗體(谷歌生物，中國)。

1.3實驗分組

本研究將軟骨細胞分為六組，進行組間比較。分組具體包括無任何干預的對照組，正常低VD組，正常高VD組，誘導組，誘導低VD組和誘導高VD組，誘導低VD組和誘導高VD組均為TNF-α和VD同時給藥。每一組軟骨細胞處理條件見表1。

1.4實驗方法

1.4.1 軟骨細胞分離、培養與鑒定

使用冰凍致死法處理新生的SD大鼠，并使用75%酒精浸泡5 min消毒。從新生大鼠關節中獲取關節軟骨組織塊，對軟骨組織塊處理并分離軟骨細胞，對軟骨細胞進行培養，并利用甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原染色對進行軟骨細胞鑒定。具體方法細節請參考我們先前的研究[23]。因軟骨細胞過度傳代會發生細胞表型改變，本實驗所用細胞均為2～3代軟骨細胞。

1.4.2 關節軟骨細胞活性測定

對各組將軟骨細胞進行活性檢測時，以2.5×104的密度接種于96孔細胞培養板中(每孔100 μL)，使細胞貼壁穩定。每組設置6個復孔，每孔加入20 μL CCK-8溶液，培養3 h。用酶標儀在490 nm波長處測定各組細胞的吸光度值，來反映活細胞數量。

1.4.3 軟骨細胞上清液中潤滑素含量的檢測

檢測各組軟骨細胞上清液中潤滑素表達時，以每孔5×104的密度將軟骨細胞接種于24孔板中，使細胞貼壁生長。每組設置3個復孔，細胞培養箱中培養。24 h后收取24孔板中培養的軟骨細胞上清液，4℃離心機1000 r/min離心20 min，抽取上清，檢測各組潤滑素的表達。

1.4.5 軟骨細胞內潤滑素合成表達的檢測

檢測各組軟骨細胞內潤滑素合成時，將軟骨細胞以5×104密度接種于24孔板，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備用于蛋白免疫印跡檢測的蛋白樣品。制作6%分離膠、5%濃縮膠，取30 μg樣品蛋白上樣，以90 V恒壓電泳，樣品進入分離膠后140 V恒壓電泳，溴酚藍抵達分離膠底部時停止電泳。以240 mA 4℃下電轉膜120 min。取出硝酸纖維素膜，于5%BSA/TBST封閉液中室溫封閉2 h，孵育Lubricin或GAPDH一抗，于搖床上4℃過夜。室溫TBST洗膜10 min，重復3次，添加相應二抗，搖床上室溫孵育1 h。室溫TBST洗膜10 min，重復3次，雙紅外激光掃描成像系統進行熒光顯色分析。

1.5統計學方法

表1 軟骨細胞研究分組一覽表

注：A.光鏡下軟骨細胞；B.甲苯胺藍染色；C.Ⅱ型膠原免疫熒光染色；D.軟骨細胞維生素D受體。圖1 光鏡下及染色后細胞形態觀察Note. A．Chondrocytes without staining (×10); B. Chondrocytes stained with toluidine blue (×20); C. Type II collagen (×40); D. Vitamin D receptor in chondrocytes (×20).Fig.1 Microscopic images of chondrocytes observed using different staining

2 結果

2.1關節軟骨細胞及維生素D受體鑒定

通過光學顯微鏡觀察，所培養的細胞形態符合軟骨細胞特點(圖1A)。通過甲苯胺藍染色和免疫熒光染色，分別可觀察到蛋白聚糖(圖1B)和Ⅱ型膠原表達(圖1C)。免疫細胞化學顯示軟骨細胞表面表達有維生素D受體(圖1D)。

2.21α,25(OH)2D3對關節軟骨細胞活性的調節作用

圖2結果顯示，TNF-α誘導并不能降低軟骨細胞活性(P> 0.05)。相對于對照組軟骨細胞，1α,25(OH)2D3干預對正常軟骨細胞活性有促進作用，但正常低VD組和正常高VD組差異無顯著性。對于TNF-α誘導的軟骨細胞，誘導低VD組和誘導高VD組均提高了誘導后軟骨細胞活性，但兩組之間差異無顯著性(P> 0.05)。

2.31α,25(OH)2D3對關節軟骨細胞上清中潤滑素分泌的影響

圖3結果顯示，1α,25(OH)2D3干預對正常軟骨細胞(無誘導)潤滑素表達差異無顯著性(P> 0.05)。TNF-α誘導后，軟骨細胞(誘導組)上清中潤滑素表達明顯降低(相對于對照組，P< 0.05)。1α,25(OH)2D3進一步干預可顯著提高軟骨細胞潤滑素的細胞外分泌(P< 0.05)。并且誘導低VD組和誘導高VD組軟骨細胞上清中潤滑素表達差異有顯著性(P< 0.05)。

注：A. TNF-α誘導對正常軟骨細胞活性的影響；B. 1α,25(OH)2D3干預對正常軟骨細胞活性的影響；C. 1α,25(OH)2D3干預對TNF-α誘導的軟骨細胞活性的影響。1.對照組；2.誘導組；3.正常低VD組；4.正常高VD組；5.誘導低VD組；6.誘導高VD組。 *表示P < 0.05，NS表示P > 0.05。圖2 CCK-8測定的各組軟骨細胞活性比較Note. A. Effects of TNF-α stimulation; B. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the normal chondrocytes; C. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the chondrocytes stimulated by TNF-α. 1.Control group; 2.TNF-α stimulated group; 3.Normal low VD group; 4.Normal high VD group; 5.Stimulated low VD group; 6.Stimulated high VD group.* indicates P < 0.05，NS indicates P> 0.05. Fig.2 Comparison of activities of chondrocytes from all the groups by CCK-8

注：A.TNF-α誘導對正常軟骨細胞潤滑素分泌的影響；B. 1α,25(OH)2D3干預對正常軟骨細胞潤滑素分泌的影響；C. 1α,25(OH)2D3干預對TNF-α誘導的軟骨細胞潤滑素分泌的影響。1.對照組；2.誘導組； 3.正常低VD組；4.正常高VD組；5.誘導低VD組；6.誘導高VD組。*表示P < 0.05，NS表示P > 0.05。圖3 各組軟骨細胞上清潤滑素表達比較Note. A. Effects of TNF-α stimulation; B. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the normal chondrocytes; C. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the chondrocytes stimulated by TNF-α. 1.Control group; 2.TNF-α stimulated group; 3.Normal low VD group; 4.Normal high VD group; 5.Stimulated low VD group; 6.Stimulated high VD group.* indicates P<0.05，NS indicates P>0.05. Fig.3 Expression of lubricin in the supernatant of cultured chondrocytes

2.41α,25(OH)2D3對關節軟骨細胞胞內潤滑素合成的影響

圖4和圖5結果表明，1α,25(OH)2D3干預對無誘導的軟骨細胞潤滑素表達差異無顯著性(P> 0.05)。TNF-α誘導后，軟骨細胞(誘導組)中潤滑素表達降低(相對于對照組，P< 0.05)。1α,25(OH)2D3進一步干預，誘導低VD組和誘導高VD組均顯著上調了軟骨細胞內潤滑素的分泌(P< 0.05)，且誘導高VD組分泌的潤滑素量顯著高于誘導低VD組(P<0.05)。

注：1.對照組；2.誘導組；3.正常低VD組；4.正常高VD組；5.誘導低VD組；6.誘導高VD組。圖4 軟骨細胞中潤滑素蛋白免疫印跡檢測結果Note.1.Control group; 2.TNF-α stimulated group; 3.Normal low VD group; 4.Normal high VD group; 5.Stimulated low VD group; 6.Stimulated high VD group.Fig.4 Expression of lubricin in chondrocytes detected by Western blot

注：A. TNF-α誘導對正常軟骨細胞潤滑素表達的影響；B. 1α,25(OH)2D3干預對正常軟骨細胞潤滑素表達的影響；C. 1α,25(OH)2D3對TNF-α誘導的軟骨細胞的影響。1.對照組；2.誘導組；3.正常低VD組；4.正常高VD組；5.誘導低VD組；6.誘導高VD組。*表示P < 0.05，NS表示P > 0.05。圖5 各組軟骨細胞內潤滑素表達的比較Note. A. Effects of TNF-α stimulation; B. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the normal chondrocytes; C. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the chondrocytes stimulated by TNF-α. 1.Control group; 2.TNF-α stimulated group; 3.Normal low VD group; 4.Normal high VD group; 5.Stimulated low VD group; 6.Stimulated high VD group.* indicates P < 0.05，NS indicates P > 0.05.Fig.5 Expression of lubricin in the chondrocytes

3 討論

潤滑素是關節軟骨的一種保護性蛋白，在維持關節正常生理功能中發揮著重要作用。在骨性關節炎起始與發展的過程中，關節軟骨表面的潤滑素表達是降低的[24]。潤滑素分泌的降低可能意味著關節軟骨表面邊界潤滑能力的下降、關節軟骨表面摩擦系數的增高和軟骨磨損的增加。并且，關節軟骨摩擦系數的增加引起的表面物理性改變可以導致關節軟骨生物性改變，即逐漸引起軟骨表面軟骨細胞的凋亡，過度分泌MMP等基質金屬蛋白酶和炎癥因子，加速關節軟骨的降解[25, 26]。分泌的炎癥因子會進一步導致關節軟骨潤滑素的降低，形成一種惡性循環[25]。因此，潤滑素在OA的發生發展中所起的作用不可忽視。

我們使用了炎癥因子TNF-α對軟骨細胞進行干預，誘導關節軟骨細胞炎癥反應，模擬骨性關節炎發生時軟骨細胞的改變。TNF-α是一種在骨性關節炎起始和發展中發揮重要作用的炎癥因子，可以明顯促進軟骨細胞的分解代謝[27, 28]。研究結果顯示，相對于沒有TNF-α干預的正常軟骨細胞，TNF-α干預確實可導致軟骨細胞上清中及胞質中潤滑素表達降低，這與Jones有關生長因子和細胞因子對潤滑素生物調節的研究結果相似，同時與臨床觀察到的骨性關節炎時潤滑素表達下降的結果相呼應[5]。

在臨床流行病學研究中，維生素D水平與骨性關節炎的發生發展關系尚不明確[29]。這可能與影響流行病學研究結果的因素錯綜復雜有關。近來越來越多的研究結果顯示維生素D對關節軟骨退變能起到重要的抑制作用[20, 29]。本研究首先證實了大鼠軟骨細胞中維生素D受體(VDR)的表達，Tetlow在人體軟骨細胞研究中也發現了VDR的存在[19]。同時，實驗結果顯示無論是在正常狀態下的軟骨細胞還是炎癥狀態下的軟骨細胞，維生素D都能提高軟骨細胞的活性，說明維生素D能夠促進軟骨細胞的生長和增殖。對于TNF-α誘導后的軟骨細胞，酶聯免疫吸附反應與蛋白免疫印跡的結果表明，無論是胞外潤滑素分泌水平還是在胞質內合成水平，1α,25(OH)2D3干預可以顯著抑制因TNF-α干預導致的潤滑素表達下降。而且，隨著劑量的增加，對潤滑素表達的影響亦增加。這說明1α,25(OH)2D3可以升高骨性關節炎的軟骨細胞潤滑素的表達，在骨性關節炎過程中，可能通過促進潤滑素的表達來保護關節軟骨。

然而對于未經TNF-α誘導的正常軟骨細胞，1α,25(OH)2D3干預雖然可以提升軟骨細胞活性，但并沒有顯著升高關節軟骨細胞潤滑素的表達水平。首先，結果說明維生素D發揮生物反應可能與細胞所處的狀態相關，炎癥狀態下的軟骨細胞和正常狀態下的軟骨細胞分泌潤滑素對維生素D的敏感度有顯著差異。Li等[20]在關于1α,25(OH)2D3對軟骨細胞CTXII和TGF-β研究中也發現了類似的現象。在正常生理狀態下的關節軟骨，1α,25(OH)2D3干預不能增加其潤滑素的表達，可能不能通過該途徑來預防骨性關節炎的發生；而一旦處于骨性關節炎狀態，1α,25(OH)2D3可促進炎癥狀態下的軟骨細胞潤滑素的表達，可能成為維生素D保護關節軟骨的途徑之一。另外，TNF-α誘導可以降低軟骨細胞潤滑素的表達，但對細胞活性沒有顯著影響；1α,25(OH)2D3干預正常軟骨細胞可以增加細胞活性，但對軟骨細胞潤滑素分泌沒有顯著影響；不同劑量的1α,25(OH)2D3干預TNF-α誘導的軟骨細胞，可以顯著影響潤滑素的表達，但對細胞活性沒有顯著影響。這些結果提示潤滑素的分泌與軟骨細胞活性沒有必然聯系，可能跟細胞炎癥與否狀態相關，這個問題尚待進一步研究。

骨性關節炎的多發性和復雜性長期困擾著患者和醫療工作者。盡管維生素D對關節作用的機制還不十分明確，但其對關節積極的保護使其成為一個極具前景的選擇。并且，目前已有研究證明人重組潤滑素可以改善關節炎癥狀，但距其應用于臨床還有一段距離。維生素D可以促進炎癥狀態下的軟骨細胞潤滑素分泌表達這一作用，提供了一個新的思路，值得我們進一步探討。

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1α,25(OH)2D3regulatesexpressionoflubricinofchondrocytesinratarticularcartilage

NIU Guo-dong, LI Si-wei, LIU Zhong-jun, SONG Chun-li, LENG Hui-jie*

(Department of Orthopedics, Peking University Third Hospital, Beijing 100191,China)

ObjectiveTo investigate the effects of vitamin D on synthesis and secretion of lubricin in chondrocytes at the cellular level.MethodsRat articular chondrocytes were stimulated by TNF-α. Normal and inflammatory chondrocytes were treated by different doses of vitamin D respectively. ELISA and Western Blot were used to detect the secretion of lubricin in the supernatant and the synthesis level in the cells.ResultsTNF-α significantly reduced the activity of both normal chondrocytes and chondrocytes in inflammatory state. TNF-α also significantly reduced the expression of lubricin in the cells and supernatant.1α,25(OH)2D3 increased the activity of both normal chondrocytes and chondrocytes in inflammatory state. 1α,25(OH)2D3 significantly elevated the secretion and expression of supernatant and intracellular lubricin only in chondrocytes stimulated by TNF-α in a dose-dependent manner, but not in normal chondrocytes.ConclusionsVitamin D can promote the secretion and expression of lubricin in inflammatory state chondrocytes, which may act as one of the mechanisms of vitamin D protecting the cartilage surface in osteoarthritis.

Vitamin D; Lubricin; Chondrocytes; Osteoarthritis

R-33

A

1671-7856(2017)010-0028-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.010.006

2017-04-20

國家自然科學基金(編號：11472017)。

牛國棟(1985 - )，男，碩士，主要從事骨性關節炎方面的研究。E-mail: tiankun23@163.com

冷慧杰(1975 - )，男，博士，副研究員，主要從事骨與關節力學生物學研究。E-mail: lenghj@bjmu.edu.cn