廣東省2014～2016年普通級兔和豚鼠病毒抗體監(jiān)測與分析

吳瑞可，王 靜，潘金春，李秀珍，陳梅玲，黃樹武，閔凡貴

(廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

研究報告

廣東省2014～2016年普通級兔和豚鼠病毒抗體監(jiān)測與分析

吳瑞可，王 靜，潘金春，李秀珍，陳梅玲，黃樹武，閔凡貴*

(廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

目的依據(jù)GB 14922.2標(biāo)準(zhǔn)中SPF級動物質(zhì)量要求，對2014～2016年廣東省生產(chǎn)許可單位的普通級兔和豚鼠進(jìn)行病毒抗體監(jiān)測，分析從普通級動物中篩查SPF級動物的可行性。方法累計收集到來自6家單位9批次的167只普通級兔和155只普通級豚鼠血清樣本，采用ELISA方法檢測GB 14922.2標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的SPF級動物排除的病毒抗體。結(jié)果兔出血癥病毒(RHDV)免疫陽性率85.4%(134/157)，10只非免動物抗體均為陰性，兔輪狀病毒(RRV)陽性率42.5%(71/167)，兔仙臺病毒(SV)結(jié)果均為陰性。豚鼠呼腸孤病毒Ⅲ型(REO-3)陽性率52.9%(82/155)，豚鼠小鼠肺炎病毒(PVM)陽性率20%(31/155)，仙臺病毒(SV)和淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)均為陰性。結(jié)論普通級兔和豚鼠雖然滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求，但SPF級動物質(zhì)量要求排除的病原污染率較高，表明不適宜通過群體篩查獲得滿足SPF級質(zhì)量要求的動物。

普通級；兔；豚鼠；病毒；抗體檢測

兔和豚鼠是目前國內(nèi)使用量較大、標(biāo)準(zhǔn)化程度較高的實驗動物，廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)研究和醫(yī)藥檢驗等領(lǐng)域。隨著科學(xué)研究和醫(yī)藥檢驗要求的提高，清潔級和SPF級兔和豚鼠的用量逐步增加，但因受制于較高的生產(chǎn)和使用成本，清潔級及SPF級兔和豚鼠尚未獲得廣泛應(yīng)用，目前，仍以普通級兔和豚鼠為主。從家兔流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果來看，兔輪狀病毒(rabbit rotavirus, RRV)和兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)感染率較高[1,2]，并且對動物健康危害較大。國內(nèi)關(guān)于豚鼠病毒的流行病調(diào)查較少，相關(guān)報道顯示淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)是對豚鼠健康威脅較大的病毒[3,4]。

由于普通級兔和豚鼠生產(chǎn)設(shè)施的環(huán)境質(zhì)量控制措施有限，導(dǎo)致動物病原暴露機(jī)會增加，加之普通級動物需排除的病原較少，部分條件性致病微生物可能直接影響動物的質(zhì)量及動物實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。本研究依照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 14922.2規(guī)定的SPF級動物質(zhì)量要求[5]，對2014～2016年本機(jī)構(gòu)監(jiān)督抽查的普通級兔和豚鼠的樣本進(jìn)行檢測，分析病原攜帶情況，探討在普通級動物群體中篩查SPF級動物的可行性，以期為實驗動物生產(chǎn)、管理、使用和實驗動物標(biāo)準(zhǔn)的制(修)訂提供參考。

1 材料和方法

1.1血清樣品

2014～2016年，累計收集到來自廣東省內(nèi)6家實驗動物生產(chǎn)單位(分別定義為A、B、C、D、E、F單位)的9批次167份普通級兔和155份普通級豚鼠血清，每批次抽樣數(shù)量為5～25個。兔均為新西蘭系，豚鼠主要以FMMU、Hartley等白化品系為主，并有少量三色豚鼠。兔經(jīng)耳緣靜脈或耳中央動脈采血，豚鼠經(jīng)心臟采血，分離血清，-80℃保存。

1.2主要試劑和儀器

ELISA試劑盒均源于美國XpressBio公司，購自蘇州西山生物科技有限公司。本次檢測兩種動物共計七種病毒的ELISA試劑分別為：兔出血癥病毒(RHDV)ELISA試劑(批號：K7057)、兔輪狀病毒(RRV)ELISA試劑(批號：K6951)、兔仙臺病毒(SV)ELISA試劑(批號：K6970)，豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)ELISA試劑(批號：K6948)、豚鼠小鼠肺炎病毒(PVM)ELISA試劑(批號：K6947)、豚鼠呼腸孤病毒III(REO-3)ELISA試劑(批號：K6617)、豚鼠仙臺病毒(SV)ELISA試劑(批號：K7008)。

酶標(biāo)儀為Thermo Multiskan Fc；洗板機(jī)為伯樂BIO-RAD1575酶標(biāo)洗板機(jī)；恒溫培養(yǎng)箱為上海躍進(jìn)PYX-DHS隔水式電熱恒溫箱。

1.3實驗方法

1.3.1 檢測項目

兔病毒檢測項目包RRV、RHDV和仙臺病毒(Sendai virus, SV)。豚鼠病毒檢測項目包括呼腸孤病毒III(Reovirus type III, REO-3)、小鼠肺炎病毒(Pneumonia virus of mice, PVM)、SV和LCMV。

1.3.2 檢測方法

根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行抗體檢測。兔、豚鼠各病毒均按以下步驟進(jìn)行檢測：將血清樣本1：50稀釋，再向ELISA 微孔板對應(yīng)的樣品孔各加100 μL稀釋好的樣本和陰性、陽性對照(陰性、陽性對照不稀釋)， 37℃孵育45 min后洗板5次，拍干微孔板；每孔加100 μL酶標(biāo)二抗，37℃孵育45 min后洗板5次，拍干微孔板；加顯色液室溫孵育30 min；反應(yīng)完畢，立即用酶標(biāo)儀讀板，測試波長為405 nm。

結(jié)果判定方法：樣本(或?qū)φ?OD值=特異孔OD值-非特異孔OD值；陽性對照OD值≥0.600，陰性對照OD值≤0.250，則試驗成立；樣本OD值≥0.300判為陽性，樣本OD值<0.300判為陰性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

根據(jù)病原的免疫和感染情況，分別計算抗體陽性率，評價免疫保護(hù)率和感染率。抗體陽性率為抗體陽性的個體數(shù)量占采樣總量的百分比；免疫保護(hù)率為免疫群體中抗體檢測結(jié)果為陽性的個體數(shù)量占采樣總量的百分比；某病毒感染率是指該病的陽性個體數(shù)占總采樣數(shù)量的百分比，而已知群體并未曾針對該病毒進(jìn)行過免疫。

2 結(jié)果

2.1普通級兔檢測結(jié)果

本次檢測結(jié)果見表1。對于普通級兔，國家標(biāo)準(zhǔn)只對RHDV做出規(guī)定，可以免疫，也可不免疫。除E單位2016年未進(jìn)行免疫外，其他單位各抽樣時間段均進(jìn)行了免疫，免疫后群體抗體陽性率均在70%以上，3年的總體陽性率為85.4%(134/157)，未免疫的動物抗體均為陰性。

SPF級兔另需排除的2種病毒RRV和SV。除E單位未檢出RRV外，其他5家受檢單位均檢出RRV，3年的總體檢出率為42.5%(71/167)；對于SV，3年來，所有單位均未檢出。

表1 2014～2016年普通級兔檢測結(jié)果

注：*表示動物已免疫；#表示動物未免疫。

Note.*，indicates that animals have been vaccinated; #，indicates that animals are not vaccinated.

表2 2014～2016年普通級豚鼠檢測結(jié)果

2.2普通級豚鼠檢測結(jié)果

普通級豚鼠檢測結(jié)果見表2。對于普通級豚鼠，國家標(biāo)準(zhǔn)只對LCMV做出規(guī)定，要求陰性，3年來所有抽檢的樣本檢測結(jié)果均為陰性。

清潔級豚鼠要求進(jìn)一步排除SV，SPF級豚鼠在清潔級基礎(chǔ)上排除REO-3和PVM。3年來，所有抽檢的動物均未檢測到SV，但PVM和Reo-3抗體陽性率均較高，PVM的總體檢出率為20%(31/155)，Reo-3的總體檢出率為52.9%(82/155)。

3 討論

隨著生物醫(yī)藥行業(yè)的快速發(fā)展，普通級兔和豚鼠已經(jīng)不能完全滿足科研和檢驗需求，而清潔級和SPF級兔和豚鼠的產(chǎn)能有限，從普通級動物群體中篩選滿足清潔級和SPF級動物質(zhì)量要求的兔和豚鼠成為解決當(dāng)前供求矛盾的捷徑。本研究對2014～2016年監(jiān)督抽查的樣本進(jìn)行了復(fù)測，涵蓋SPF級動物質(zhì)量要求排除的病毒項目，旨在了解目前普通級動物病毒的感染情況，為動物實驗應(yīng)用和動物篩查提供參考。

從本次調(diào)查結(jié)果來看，普通級兔RHDV群體免疫合格率均達(dá)到70%，未免疫的動物抗體檢測結(jié)果均為陰性，符合國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。RRV是SPF級兔要求排除的病毒，調(diào)查結(jié)果顯示該病毒感染率較高，9次抽檢結(jié)果僅1次未檢出，表明該病毒污染嚴(yán)重。SV已被證實可影響家兔的熱原試驗，存在交叉感染[6，7]，也是SPF級兔要求排除的病原，此次調(diào)查未發(fā)現(xiàn)普通級兔攜帶SV。

普通級豚鼠均未檢出LCMV，滿足普通級動物質(zhì)量要求。同時，所有動物均未檢出SV，表明SV感染率極低，可以通過日常管理控制該病原。然而，SPF級豚鼠要求排除的2種病毒Reo-3和PVM的感染率均較高，表明基于現(xiàn)有的普通級豚鼠群體篩查滿足SPF級質(zhì)量要求的動物可行性低，批量獲得滿足SPF級質(zhì)量要求豚鼠需要嚴(yán)格依照SPF級動物生產(chǎn)繁育的要求進(jìn)行生產(chǎn)繁育。

綜上調(diào)查結(jié)果，廣東地區(qū)現(xiàn)有的普通級兔和豚鼠符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的普通級動物質(zhì)量要求，但SPF級動物規(guī)定的病毒污染率高，基于普通級動物群體篩選高質(zhì)量動物的可行性不高，需要建立SPF種群進(jìn)行生產(chǎn)繁育。

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[3] 李雨函，魏強(qiáng). 淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染實驗動物的情況概述[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(1):46-49.

[4] 周娉，董偉，劉建高，等. 湖南省實驗動物中幾種常見的人獸共患病監(jiān)測[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009,19(3):74-75.

[5] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. 實驗動物 微生物等級及監(jiān)測[S].GB/T 14922. 2-2011.

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SurveillanceandanalysisofvirusantibodiesinconventionalrabbitsandguineapigsinGuangdongProvinceduring2014-2016

WU Rui-ke， WANG Jing， PAN Jin-chun， LI Xiu-zhen， Chen Mei-ling， HUANG Shu-wu， MIN Fan-gui*

(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663，China)

ObjectiveTo analyze the possibilities of screening SPF rabbits and guinea pigs from conventional animals, viral antibodies of the conventional rabbits and guinea pigs bred by licensed companies in Guangdong province during 2014 -2016 were determined according to the standard of SPF animals in GB14922.2.MethodsNine batches of 167 rabbit sera and 155 guinea pig sera were sampled from 6 companies. Serum antibodies to virus were determined by ELISA according to GB14922.2.ResultsPositivity of antibody to rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) was 82.2% (129/157) for the vaccinated rabbits, and negative result were obtained for unvaccinated rabbits. Positive rate of rabbit rotavirus (RRV) was 42.5% (71/167). No positive antibody responses to Sendai virus were detected out in all rabbits. The positive rates of guinea pig reovirus type III (REO-3) and pneumonia virus of mice (PVM) were 52.9%(82/155)and 20% (31/155) respectively. Antibody responses to Sendai virus (SV) and lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) were negative in all guinea pigs.ConclusionsAlthough the conventional rabbits and guinea pigs could meet the national standard, higher infection rates of virus excluded that SPF animals emerged in conventional animals, indicating that selection of SPF animals from conventional colonies is impracticable.

Conventional animals; Rabbits; Guinea pigs; Virus; Antibody detection

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0065-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.013

2017-03-16

國家科技支撐計劃項目(2015BAI07B01)； 廣東省科技計劃項目(2015A030302028)。

吳瑞可(1984-)，女，本科，研究方向：實驗動物微生物學(xué)。 E-mail: 359295772@qq.com

閔凡貴(1980.2-)，男，碩士，副研究員，研究方向：實驗動物與比較醫(yī)學(xué)研究。E-mail: minfangui@aliyun.com