上調(diào)miR-320a對(duì)注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)的肝癌 Bel-7402細(xì)胞凋亡和遷移的影響

呂曉婷，郭 珮,，宋 丹，熊 偉，石雪萍，李海星，李 靜，冉建華

(重慶醫(yī)科大學(xué)1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細(xì)胞工程與干細(xì)胞研究室、2. 附屬第一醫(yī)院肝膽外科、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，重慶 400016)

◇論著◇

上調(diào)miR-320a對(duì)注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)的肝癌 Bel-7402細(xì)胞凋亡和遷移的影響

呂曉婷1，郭 珮1,3，宋 丹2，熊 偉1，石雪萍1，李海星1，李 靜1，冉建華3

(重慶醫(yī)科大學(xué)1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細(xì)胞工程與干細(xì)胞研究室、2. 附屬第一醫(yī)院肝膽外科、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，重慶 400016)

目的研究上調(diào) miR-320a 對(duì)注射用核糖核酸Ⅱ(BP 素)誘導(dǎo)的肝癌 Bel-7402 細(xì)胞凋亡和遷移的影響。方法用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè) miR-320a 在正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中的表達(dá)差異；將 miR-320a mimic轉(zhuǎn)染到Bel-7402細(xì)胞中，qRT-PCR法檢測(cè)miR-320a的表達(dá)水平；CCK-8法檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖的影響；FCM檢測(cè)細(xì)胞周期分布及凋亡變化；Transwell法檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移和侵襲的影響；Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)及凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Bcl-2，遷移相關(guān)蛋白MMP-3的表達(dá)。結(jié)果與正常肝細(xì)胞相比，miR-320a的表達(dá)水平在肝癌細(xì)胞中明顯下調(diào)。轉(zhuǎn)染miR-320a mimic的 Bel-7402 細(xì)胞命名為 Bel-7402-miR-320a，CCK-8結(jié)果顯示，給予注射用核糖核酸Ⅱ(100、200、300、400、500 mg·L-1)后，Bel-7402 及 Bel-7402-miR-320a細(xì)胞的增殖均受到了抑制。在 Bel-7402 和 Bel-7402-miR-320a 中，12 h半數(shù)抑制濃度為250、200 mg·L-1，24 h半數(shù)抑制濃度為150、120 mg·L-1。FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，注射用核糖核酸Ⅱ可誘導(dǎo)Bel-7402、Bel-7402-miR-320a細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，上調(diào)miR-320a后細(xì)胞凋亡率明顯增加。Transwell結(jié)果顯示，與Control組和加藥組相比，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞遷移和侵襲明顯受到抑制。Western blot結(jié)果顯示，注射用核糖核酸Ⅱ作用Bel-7402和Bel-7402-miR-320a細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax的表達(dá)增加，而 Cyclin D1、Bcl-2、MMP-3蛋白的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論miR-320a在肝癌Bel-7402細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于正常肝細(xì)胞。注射用核糖核酸Ⅱ可以通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白 Cyclin D1的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，激活p53信號(hào)通路，下調(diào) Bcl-2、上調(diào)Bax，破壞Bcl-2/Bax的比例，促進(jìn)人肝癌Bel-7402細(xì)胞的凋亡，并通過抑制MMP-3的表達(dá)抑制人肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。而過表達(dá) miR-320a后，可提高肝癌細(xì)胞對(duì)注射用核糖核酸Ⅱ的敏感性，增強(qiáng)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞Bel-7402的作用。

注射用核糖核酸Ⅱ；microRNA-320a；肝細(xì)胞肝癌；Bel-7402；凋亡；遷移

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，主要包括膽管細(xì)胞癌和肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，其中HCC占原發(fā)性肝癌發(fā)病率的90%。HCC是世界上最常見的一種具有侵襲性的人類惡性腫瘤，具有惡性程度高、早期診斷率低、預(yù)后差和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1]。盡管對(duì)HCC發(fā)生、發(fā)展過程的研究有了很大的進(jìn)展，但是HCC病變的精確機(jī)制仍然不明確。在過去的幾年中，HCC的5年生存率變化也不大[2]，這就強(qiáng)調(diào)了HCC早期診斷及治療的重要性。

注射用核糖核酸Ⅱ(BP素)是從牛胰腺中提取的核糖核酸，是一種高純度的具有生理活性的物質(zhì)[3]。它既可以非特異性促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的成熟、分化，還可以使受到抑制的免疫功能得以恢復(fù)，從而增強(qiáng)人體免疫功能。已有相關(guān)文獻(xiàn)證明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程與機(jī)體的免疫功能具有相關(guān)性。臨床試驗(yàn)中，已有多項(xiàng)研究表明，注射用核糖核酸Ⅱ在治療多種癌癥中發(fā)揮重要作用[3]。其中，應(yīng)用注射用核糖核酸Ⅱ治療可使肝癌結(jié)節(jié)體積明顯縮小[4]，但其具體的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。

小分子核糖核酸(microRNAs)是一類小型非編碼RNA，主要存在于動(dòng)物和植物中，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[5]。在人類腫瘤疾病中，microRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a在乳腺癌、結(jié)腸癌和白血病中表達(dá)下調(diào)[7]，提示miR-320a可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。miR-320a可以通過下調(diào)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制HCC細(xì)胞的增殖[8]。上調(diào) miR-320a對(duì)注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)的肝癌 Bel-7402細(xì)胞產(chǎn)生何種影響？目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料

1.1藥物與試劑注射用核糖核酸Ⅱ(規(guī)格50 mg)購自吉林敖東藥業(yè)，由冉建華教授提供；轉(zhuǎn)染試劑購自RIBOBIO；PCR試劑購自GeneCopoeia；青霉素-鏈霉素溶液(100×)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、RIPA裂解液(強(qiáng))、PMSF(100 nmol·L-1)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、CCK-8試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；p53、Bax、Bcl-2等抗體購自沈陽萬類科技有限公司。

1.2儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Forma Scientific公司；正置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；FACScan 型流式細(xì)胞儀，BectonDickinson公司；ChemiDocTMTouch Image Syste化學(xué)發(fā)光儀，Bio-Rad公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)正常的肝細(xì)胞株HL-7702和人HCC細(xì)胞株Hep3B、Bel-7402均購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)。分別以30%～50%細(xì)胞濃度接種于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，每24～48 h 傳代1次。

2.2總RNA提取及定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 收集正常肝細(xì)胞 HL-7702 及肝癌細(xì)胞 Hep3B、Bel-7402 后，加1 mL TRIzol，上下倒置震蕩后，加1 ∶1氯仿去除蛋白，加2 ∶1異丙醇去除沉淀，提取總 RNA，在260 nm 和280 nm 時(shí)測(cè)得吸光度進(jìn)行配平，然后將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。使用 GeneCopoeia 試劑，按照說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞中miR-320a 的表達(dá)水平及 miR-320a 的轉(zhuǎn)染效率。反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性10 min，45個(gè)循環(huán)的95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，實(shí)驗(yàn)設(shè)2個(gè)復(fù)孔，以 U6作為內(nèi)參進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。

2.3細(xì)胞株轉(zhuǎn)染在6孔板中分別加入3 mL含有30%～50%細(xì)胞濃度的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁后，吸出6孔板內(nèi)的完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分3組，第1組為陰性對(duì)照組：用120 μL riboFECTMCP Buffer 稀釋10 μL miR-320a negative control，輕輕混勻后，加入12 μL riboFECTMCP Reagent，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15 min，最后將混合液加入到完全培養(yǎng)基中，最終體積為2 mL；第2組為空白對(duì)照組：為常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞，僅加入2 mL完全培養(yǎng)基；第3組為miR-320a組：同第1組，將稀釋好的miR-320a mimic混合液加入到完全培養(yǎng)基中，最終體積為2 mL。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，通過qRT-PCR檢測(cè)miR-320a的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染miR-320a mimic的Bel-7402細(xì)胞命名為Bel-7402-miR-320a。

2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×109·L-1接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)分為兩組：第1組為對(duì)照組，即Bel-7402組；第2組為給藥組，分別加入含終濃度為100、200、300、400、500 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL。分別培養(yǎng)12、24 h后，每孔加10 μL CCK-8試劑，37℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值(A)。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和12、24 h的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration, IC50)，以IC50為標(biāo)準(zhǔn)，確定藥物最適作用濃度和時(shí)間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率/%=(Acontrol組-A注射用核糖核酸Ⅱ組)/(Acontrol組-A空白對(duì)照組)×100%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bel-7402-miR-320a細(xì)胞，也分為對(duì)照組和給藥組，檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)?Bel-7402-miR-320a細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率和IC50。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×109·L-1接種于6孔板。實(shí)驗(yàn)分為3組，第1組為對(duì)照組：為常規(guī)培養(yǎng)的Bel-7402細(xì)胞；第2組為 Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組，給予含終濃度為150 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ的完全培養(yǎng)基；第3組為Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組，給予含終濃度為120 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ的完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔3 mL，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，70%冰乙醇重懸，4℃固定過夜。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，通過軟件分析得出細(xì)胞周期分布比例。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分組同“2.5”，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集全部細(xì)胞，按照 AnnexinV-FTIC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書方法，染色30 min后，上機(jī)檢測(cè)，采用CELIQUEST軟件分析得出細(xì)胞周期和凋亡的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7Transwell法檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移和侵襲的影響實(shí)驗(yàn)分組同“2.5”，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將各組細(xì)胞消化下來。各組細(xì)胞以1×109·L-1每孔的密度接種于小室上端，培養(yǎng)于200 μL無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，小室下端加入300 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，注意不要超過小室上端，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將小室用刀片沿邊緣輕輕切下，PBS洗3次后，用多聚甲醛固定30 min，最后用結(jié)晶紫染色30 min，200倍顯微鏡下觀察拍照。

2.8Westernblot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白和凋亡蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)分組同“2.5”，培養(yǎng)24 h后，分別用全蛋白裂解液抽提試劑盒抽提蛋白。采用BCA法檢測(cè)各組蛋白的濃度，每一樣品取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE分離蛋白，隨后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上；封閉液37℃封閉2 h，4℃孵育一抗過夜。TBST 洗膜3次，37℃孵育二抗1 h，TBST洗膜3次后，用ECL法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1miR-320a在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)差異qRT-PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞HL-7702與肝癌細(xì)胞Hep3B、Bel-7402中miR-320a的表達(dá)情況。Fig 1結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞相比，Hep3B和Bel-7402中miR-320a的表達(dá)下調(diào)。其中，Bel-7402細(xì)胞中miR-320a的下調(diào)更為明顯，故將Bel-7402細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

Fig 1 Analysis of miR-320a expression in normalhepatic cell lines and HCC cell lines

*P<0.05vsHL-7702

3.2Bel-7402-miR-320a細(xì)胞的獲得將Bel-7402細(xì)胞株按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以轉(zhuǎn)染了miR-320a negative control的Bel-7402細(xì)胞為陰性對(duì)照組(Bel-7402-NC)，常規(guī)培養(yǎng)的Bel-7402細(xì)胞為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-320a mimic的為過表達(dá)miR-320a組(Bel-7402-miR-320a)，用 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞株中miR-320a的表達(dá)水平。Fig 2結(jié)果表明，與Bel-7402-NC相比較，Bel-7402-miR-320a組細(xì)胞中miR-320a的表達(dá)量明顯增高(P<0.05)，而 Bel-7402-NC組與Bel-7402組相比，差異變化不明顯。

Fig 2 Transfection efficiency test ofmiR-320a in Bel-7402 cells

*P<0.05vsBel-7402-NC

3.3注射用核糖核酸Ⅱ?qū)el-7402和Bel-7402-miR-320a細(xì)胞的增殖抑制作用CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 3)，對(duì)照組細(xì)胞體外生長(zhǎng)活躍，經(jīng)注射用核糖核酸Ⅱ(100、200、300、400、500 mg·L-1)處理后，Bel-7402和Bel-7402-miR-320a細(xì)胞的增殖均受到抑制，計(jì)算12 h半數(shù)抑制濃度為250、200 mg·L-1，24 h 半數(shù)抑制濃度為150、120 mg·L-1，且注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞Bel-7402及 Bel-7402-miR-320a的生長(zhǎng)抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。

Fig 3 Inhibitory effect of ribonucleic acid Ⅱ on Bel-7402 andBel-7402-miR-320a cells after treatment for 12, 24 h

3.4注射用核糖核酸Ⅱ?qū)el-7402和Bel-7402-miR-320a細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示(Tab 1、Fig 4)，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組的 G0/G1期的細(xì)胞比例(60.01±1.00)%和Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組的G0/G1期細(xì)胞比例(71.39±3.07)%均高于Bel-7402組的(52.27±0.97)%，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。與 Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組相比，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組的G0/G1期細(xì)胞比例增高更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.5注射用核糖核酸Ⅱ?qū)el-7402和Bel-7402-miR-320a細(xì)胞凋亡的影響B(tài)el-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞凋亡率為(21.53±1.62)%，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞凋亡率為(27.88±0.89)%，均高于 Control組(7.80±1.13)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞凋亡率高于Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Tab 2、Fig 5。

3.6注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移和侵襲的影響Transwell法檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移和侵襲的影響。Fig 6結(jié)果顯示，與Control組相比，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組和Bel-7402-miR-320a +Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到了抑制；與Bel-7402+ Ribonucleic acid Ⅱ組相比，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞遷移和侵襲能力受抑更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Tab 1 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on cell cycle of Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells(±s，n=3 )

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsBel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ

Fig 4 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on cell cycle of Bel-7402 and Bel-7402- miR-320a cells

A: Control; B: Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ; C: Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ

Fig 5 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on apoptosis of Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells

A: Control; B: Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ; C: Bel-7402- miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ

Tab 2 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on apoptosisof Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells(±s，n=3 )

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsBel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ

Fig 6 Effect of ribonucleic acid Ⅱ on migration andinvasion of Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsBel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ

3.7注射用核糖核酸Ⅱ?qū)el-7402和Bel-7402-miR-320a細(xì)胞CyclinD1、p53、Bax、Bcl-2、MMP-3表達(dá)的影響Fig 7結(jié)果顯示，與Control組相比，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組和 Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax的表達(dá)增加，而 Cyclin D1、Bcl-2、MMP-3蛋白表達(dá)水平下調(diào)。與 Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組相比，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組蛋白變化水平更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 討論

HCC具有惡性程度高、早期診斷率低、預(yù)后差的特點(diǎn)。在過去十年中，它已成為全世界的一個(gè)最頻繁發(fā)生的腫瘤，是癌癥系統(tǒng)最致命的疾病之一，大約占所有惡性腫瘤的三分之一，其發(fā)病率及病死率居高不下[9]。HCC患者的免疫力低下，藥物治療價(jià)格昂貴。因此，尋找一種能夠提高HCC患者免疫力，同時(shí)又具有抗癌作用，且價(jià)格低廉、藥效明顯的藥物對(duì)于人類的健康是至關(guān)重要的。

Fig 7 Expression of Cyclin D1, p53, Bax, Bcl-2, MMP-3 proteins in Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells after ribonucleic acid Ⅱ treatment for 24 h

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsBel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ

注射用核糖核酸Ⅱ是從健康的牛胰腺中提取的一種可促進(jìn)腫瘤組織和細(xì)胞空泡樣變化以及液化性壞死的核糖核酸，是一種高純度的生化藥物。研究發(fā)現(xiàn)，注射用核糖核酸Ⅱ可以通過增加巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞因子來增加細(xì)胞的體液免疫功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。注射用核糖核酸Ⅱ還可以抑制血管內(nèi)皮因子的表達(dá)，抑制腫瘤新生血管的形成，從而抑制腫瘤的形成[10]。已有研究表明，應(yīng)用注射用核糖核酸Ⅱ治療，可使肝癌結(jié)節(jié)體積明顯縮小。但是目前關(guān)于注射用核糖核酸Ⅱ的報(bào)道均來自于臨床報(bào)告，其具體的作用機(jī)制目前尚不明確。

microRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA，其在腫瘤的惡化過程中發(fā)揮重要的作用，然而，microRNA在腫瘤中的異常調(diào)節(jié)機(jī)制目前我們知道的并不多[11]。許多研究表明microRNA在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，如細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲[12]。下調(diào) miR-320a基因在大腸癌中的表達(dá)，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，并導(dǎo)致預(yù)后較差[13]。因此，我們認(rèn)為miR-320a在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可作為一種抑癌基因發(fā)揮作用。

我們采用qRT-PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞HL-7702與肝癌細(xì)胞Hep3B、Bel-7402中 miR-320a的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-320a在肝癌細(xì)胞里呈低表達(dá)。Hep3B細(xì)胞是一種 HBV為陽性的肝癌細(xì)胞，其miR-320a低表達(dá)水平相對(duì)于Bel-7402細(xì)胞不明顯，有可能是由于乙型肝炎病毒的影響，但其具體原因需要更進(jìn)一步的研究。

本研究采用CCK-8法檢測(cè)了注射用核糖核酸Ⅱ?qū)el-7402細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組和Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞的增殖均受到抑制，12、24 h的半數(shù)抑制濃度分別為 250、200 mg·L-1和150、120 mg·L-1。研究證實(shí)了上調(diào) miR-320a可以增加肝癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，明顯減少藥物的用量。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組和 Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞周期均阻滯在G0/G1期，且與Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組相比，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組的G0/G1期細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率增高更為明顯。Cyclin D1是細(xì)胞周期G1期向S期過渡的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，與細(xì)胞周期密切相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組和Bel-7402-miR-320a+ Ribonucleic acid Ⅱ組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平下調(diào)。與Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組相比，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組Cyclin D1蛋白下調(diào)更明顯，與細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果一致。提示注射用核糖核酸Ⅱ可通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖；而上調(diào)miR-320a的表達(dá)水平可進(jìn)一步增強(qiáng)注射用核糖核酸Ⅱ的這一作用。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)?xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)與Control組相比，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組和Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞凋亡率增加，且與Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組相比，Bel-7402-miR-320a +Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞凋亡率增高更為明顯。p53(mtp53) 基因是一種抑癌基因，是迄今為止與人類惡性腫瘤相關(guān)性最高的腫瘤抑制基因，p53信號(hào)通路為癌癥發(fā)生過程中的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路。p53基因可以通過參與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和DNA的修復(fù)等發(fā)揮作用。Bcl-2蛋白在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，是一種抗凋亡基因，Bax是與Bcl-2同源的水溶性相關(guān)蛋白，其可以通過拮抗Bcl-2而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 Control組相比，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組和Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax的表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)。與 Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組相比，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組蛋白變化水平更明顯。提示注射用核糖核酸Ⅱ可通過激活p53信號(hào)通路，下調(diào) Bcl-2、上調(diào)Bax，破壞Bcl-2/Bax的比例來促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，上調(diào)miR-320a可增強(qiáng)這一效應(yīng)。

Transwell法檢測(cè)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)?xì)胞遷移和侵襲的影響，結(jié)果顯示，與 Control組相比，Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ組和Bel-7402-miR-320a +Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到了抑制；與Bel-7402+ Ribonucleic acid Ⅱ組相比，Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ組細(xì)胞遷移和侵襲能力受抑更為明顯。基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3, MMP-3)是MMPs家族的主要成員之一。MMP-3基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是在一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外成分、原癌基因等的作用下，刺激一系列位于MMP-3啟動(dòng)子的順式作用元件，從而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)注射用核糖核酸Ⅱ誘導(dǎo)24 h后，Bel-7402細(xì)胞內(nèi)的MMP-3蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而Bel-7402-miR-320a細(xì)胞內(nèi)的下調(diào)更明顯。提示注射用核糖核酸Ⅱ可以通過抑制MMP-3蛋白，抑制 Bel-7402細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，肝癌細(xì)胞中miR-320a的表達(dá)水平下調(diào)，注射用核糖核酸Ⅱ可以通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，通過激活p53信號(hào)通路，下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax，破壞Bcl-2/Bax的比例來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制MMP-3的表達(dá)來抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。而上調(diào)miR-320a的表達(dá)水平可促進(jìn)注射用核糖核酸Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞的作用。但miR-320a是通過何種方式增強(qiáng)注射用核糖核酸Ⅱ的作用，還需要我們進(jìn)一步研究。

(致謝：本研究在重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細(xì)胞工程與干細(xì)胞研究室完成，對(duì)實(shí)驗(yàn)給予幫助的老師和同學(xué)表示感謝！)

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EffectofmiR-320aup-regulationonapoptosisandmigrationofBel-7402cellsinducedbyribonucleicacidⅡ

LYU Xiao-ting1, GUO Pei1,3, SONG Dan2, XIONG Wei1, SHI Xue-ping1, LI Hai-xing1, LI Jing1, RAN Jian-hua3

(1.LabofStemCellandTissueEngineering,DeptofHistologyandEmbryology; 2.DeptofHepatobiliarySurgery,theFirstAffiliatedHospital; 3.DeptofAnatomy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

AimTo investigate the effect of miR-320a up-regulation on the apoptosis and migration of Bel-7402 cells induced by ribonucleic acid Ⅱ.MethodsThe different expression levels of miR-320a in normal liver cells and hepatocellular carcinoma (HCC) cells were detected by qRT-PCR. Bel-7402 cell was transfected with miR-320a mimic, and the miR-320a expression levels were measured by qRT-PCR. The effect of ribonucleic acid Ⅱ on proliferation of Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells was measured by CCK-8 assay, and cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The migration and invasion ability of ribonucleic acid Ⅱ on Bel-7402 cells were tested by Transwell method. The expression of p53, Cyclin D1, Bax, Bcl-2, MMP-3 proteins were examined by Western blot.ResultsmiR-320a expression levels in HCC cell line Bel-7402 were significantly lower than those in normal cell line HL-7702. Bel-7402 cells were successfully transfected with miR-320a mimic, named Bel-7402-miR-320a. CCK-8 showed that ribonucleic acid Ⅱ could effectively inhibit the proliferation of Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cellsinvitroin a dose-dependent manner at the range of 100, 200, 300, 400, 500 mg·L-1. The IC50of ribonucleic acid Ⅱ exposure on Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells for 12 h and 24 h was 250, 200 mg·L-1and 150, 120 mg·L-1, respectively; flow cytometric analysis indi-cated that over-expression of miR-320a could arrest Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells induced by ribonucleic acid Ⅱ in G0/G1phase, and promote the apoptosis of HCC cells. Transwell method showed that Bel-7402-miR-320a+Ribonucleic acid Ⅱ group could significantly inhibit the migration of HCC cells compared with control group and Bel-7402+Ribonucleic acid Ⅱ group. Western blot results showed that the expression of p53, Bax proteins increased, while the Cyclin D1, Bcl-2, MMP-3 proteins were down-regulated in Bel-7402 and Bel-7402-miR-320a cells induced by ribonucleic acid Ⅱ.ConclusionsThe expression of miR-320a is lower in HCC cells than that in normal cell line. While ribonucleic acid Ⅱ could promote the apoptosis of liver cancer cells by arresting the cell cycle protein expression of Cyclin D1, activating p53 signaling pathway, down-regulating Bcl-2, up-regulating Bax and destroying Bcl-2/Bax proportions, and inhibiting the migration and invasion of HCC cells by down-regulating MMP-3. Overexpression of miR-320a could increase the sensitivity and boost the pharmacological effects of ribonucleic acid Ⅱ on HCC cells.

ribonucleic acid Ⅱ; microRNA-320a; hepatocellular carcinoma; Bel-7402; apoptosis; migration

A

1001-1978(2017)11-1503-08

R322.47；R329.25；R342.2；R735.702.2；R979.1

時(shí)間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.014.html

2017-07-04，

2017-08-09

重慶市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No cstc2015jcyjA0036)

呂曉婷(1989-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤基礎(chǔ)與臨床， E-mail：sungirlxt@163.com； 李 靜(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：lijingyangyang@126.com； 冉建華(1974-)，女，博士，教授，研究方向：尿素通道蛋白生理功能及藥物開發(fā)，通訊作者，E-mail：ranjianhua2013@163.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.007