楸毒素抗E-4031所致豚鼠離體心臟和心肌細胞LQT2作用的研究

潘瑩瑩，韓 鈺，楊 帆，尹永強，康 毅，婁建石

(天津醫科大學基礎醫學院藥理學系，天津 300070)

楸毒素抗E-4031所致豚鼠離體心臟和心肌細胞LQT2作用的研究

潘瑩瑩，韓 鈺，楊 帆，尹永強，康 毅，婁建石

(天津醫科大學基礎醫學院藥理學系，天津 300070)

目的觀察楸毒素(mallotoxin, MTX)對E-4031誘發豚鼠離體心臟和心肌細胞LQT2的作用。方法采用Langendorff逆行主動脈灌流法對豚鼠離體心臟進行灌流，采集離體心臟表面Ⅱ導聯心電圖以考察低、中、高3個濃度MTX及其在應用hERG通道阻斷劑E-4031條件下，對QT/QTc間期、跨室壁離散度、電生理平衡指數的影響；酶解法分離豚鼠單個心室肌細胞，應用全細胞膜片鉗技術分別在正常和hERG通道阻斷劑E-4031存在條件下，記錄低、中、高3個濃度的MTX對動作電位時程的影響。結果MTX縮短豚鼠離體心臟QT間期，降低跨室壁離散度，減小電生理平衡指數。MTX可逆轉E-4031誘發的QT間期延長、跨室壁離散度增加和電生理平衡指數增大。MTX縮短豚鼠心室肌細胞動作電位復極時程，降低APD90、APD60、APD30，加速復極。MTX可逆轉E-4031誘發的動作電位復極時程延長。結論MTX縮短QT間期，降低復極跨室壁離散度，減小電生理平衡指數和縮短動作電位復極時程，具有抗 E-4031所致LQT2的作用。

楸毒素；長QT間期綜合征；hERG通道；QT間期；跨室壁離散度；動作電位時程

長QT綜合征(long QT syndrome, LQTS)是一類以心室復極化明顯延長為主要特點的疾病，在心電圖上通常表現為QT間期延長，T波復極跨室壁離散度(transmural dispersion of repolarization, TDR)增大[1]。截至目前，人類至少已發現15種類型的LQTS[2]。劉杰等[3]對我國19個省的77個遺傳性LQTS家系進行篩查證實，LQT2為我國最常見的LQTS類型，占LQTS的54.5%，因此，對LQT2的研究是我國近些年LQTS研究的熱點。LQT2發生涉及到快速激活延遲整流鉀電流(rapidly activating delayed outward potassium current, IKr)通道[4]。IKr是心肌細胞復極3期的主要鉀電流，在心肌細胞復極過程中起關鍵作用[5]。hERG (human ether-a-go-go)鉀通道是心肌產生IKr的分子基礎，其功能異常與QT間期異常綜合征有關[6]。

遺傳、低鉀、藥物不良反應等因素均可抑制IKr電流，導致LQT2。之前治療包括LQT2在內的LQTS的一個直接方法就是通過藥物激活鉀通道，增加復極電流，例如ATP敏感性鉀電流激動劑吡那地爾增強外向鉀電流，縮短QT間期，但其同時又增大TDR，這反而不利于從根源上減少LQTS所導致的惡性心律失常[7]。因此，尋找一類更為有效的鉀通道激動劑成為當前的一種研究方向，近年來，hERG通道激動劑對于LQT2的作用備受矚目。楸毒素(mallotoxin, MTX)是目前發現的一個天然hERG通道特異性開放劑[8]。MTX也稱為卡馬拉素，在自然界中源于大戟科植物粗糠柴果實毛茸和腺毛，具有抗生育和驅殺絳蟲的作用。但以往MTX的研究通常關注其在抗心肌缺血/再灌注損傷和抗腫瘤等特性上[9]，鮮見其抗LQTS方面的應用考察。因此，本研究將初步考察MTX對QT間期，尤其是TDR的作用，以探究其是否具有抗LQT2的可能性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康成年豚鼠，♂，體質量(270±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2藥品與試劑 MTX、膠原酶Ⅱ、MgATP、HEPES，均購自美國Sigma公司；E-4031購自美國Santa Cruz公司。

1.1.3儀器 GL-2 Langendorff灌流裝置、超級恒溫水浴，成都泰盟軟件有限公司；PHS-3C酸度計，上海精密科學儀器有限公司；16通道多導生理記錄儀，美國BIOPAC公司；Digidata 1440A數-模轉換器、Multi Clamp 700B膜片鉗放大器、MP-225三維操縱儀，美國Axon公司；IX51倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.1.4液體的配制 K-H灌流液(mmol·L-1)：NaCl 118.06、KCl 4.69、KH2PO41.18、NaHCO325、MgSO41.18、Glucose 11.11、CaCl22.5。預先通入混合氧氣(95%O2+5%CO2) 20 min后，調節pH值至7.4。 無鈣臺式液(mmol·L-1)：NaCl 140、KCl 5.4、MgCl21、HEPES 10、Glucose 10, 通純氧20 min后，用NaOH調節pH值至7.3。 細胞保存液(KB液，mmol·L-1)：L-谷氨酸 50、KOH 80、KCl 40、KH2PO425、MgSO43、牛磺酸 20、EGTA 0.5、Glucose 10, 通純氧20 min后，用KOH調節pH值至7.3。 記錄豚鼠心室肌細胞動作電位的細胞外液(mmol·L-1)：NaCl 132、CaCl21.8、KCl 4、MgCl21.2、HEPES 10、Glucose 10, 通純氧20 min后，用NaOH調節pH值至7.4。 電極內液(mmol·L-1)：KCl 140、MgCl21、MgATP 4、EGTA 5、HEPES 10, 通純氧20 min后，用KOH調節pH值至7.3。

1.2方法

1.2.1離體心臟Langendorff灌流法 用25%的烏拉坦麻醉豚鼠，隨后仰臥位固定于鼠臺之上，快速剪開胸腔暴露心臟，將主動脈根部剪斷，并取出心臟放入預冷的4℃生理鹽水中，輕輕按壓，幫助泵出殘留血液，并去除脂肪及結締組織。將預留出的主動脈于灌流裝置末端進行插管，以37℃恒溫、預通混合氧的K-H液灌流，灌注壓為8～9 kPa左右，初期排盡殘血，整個過程控制在1 min以內，以減少缺血對心臟組織造成的損傷。待心臟搏動穩定后，將心電圖記錄電極的正、負極分別貼附至心臟的心尖和主動脈根部，以記錄心電圖。

1.2.2單個豚鼠心室肌細胞的分離 用25%的烏拉坦麻醉豚鼠，取出心臟置于4℃臺氏液中，去除脂肪及結締組織。將心臟連接于Langendorff灌流裝置上，經主動脈逆行灌流。首先，以無鈣臺氏液連續灌流5 min，待洗盡殘血，心臟停止跳動后，改用30 mL含12 mg膠原酶Ⅱ的無鈣臺氏液進行循環灌流。隨著灌流的進行，流出液變得黏稠，心肌的顏色逐漸變淺、透亮，心臟體積逐漸變大、松軟。剪取酶解的心臟左心室部分，投入純氧飽和10 mL KB液中剪碎，細胞室溫放置1 h，沉降存活的心肌細胞，更換新鮮KB液以備電生理實驗使用。

1.2.3動作電位電生理記錄 在室溫25℃將細胞懸液滴于1 mL浴槽中，待細胞貼壁后，使用細胞外液以1 mL·min-1的恒速灌流。選取飽滿且橫紋清晰的梭桿狀細胞進行實驗。將阻抗為2～4 MΩ、充填電極內液的微電極與細胞膜表面形成1GΩ以上的高阻封接，在此基礎上擊破細胞膜，補償串聯電阻、細胞膜電容和漏電流形成全細胞膜片鉗記錄方式，在電流鉗模式下進行測定。動作電位記錄程序刺激方案為首先電流鉗制在0 pA，隨后向細胞內注入2 000 pA的電流，時間維持在4 ms，最后再落回0 pA，頻率設定在1 Hz進行采集記錄。信號經MultiClamp 700B膜片鉗放大器、Digidata 1440A數模轉換器采集、貯存并由Pclamp 10.0等軟件分析。

1.2.4實驗分組 正常給藥組：① 空白對照組；② 0.2 μmol·L-1MTX組；③ 0.4 μmol·L-1MTX組；④ 0.6 μmol·L-1MTX組。E-4031(10 nmol·L-1)造模組：① 空白對照組；② 10 nmol·L-1E-4031組；③ 10 nmol·L-1E-4031+0.2 μmol·L-1MTX組；④ 10 nmol·L-1E-4031+0.4 μmol·L-1MTX組；⑤ 10 nmol·L-1E-4031+0.6 μmol·L-1MTX組。

1.2.5觀測指標及方法

1.2.5.1QT/QTc間期 QT間期以1個心動周期中Q波起始至T波終止的時程計量，矯正的QT(corrected QT, QTc)間期采用較為符合豚鼠心臟心率與QT間期變化關系的公式QTc=QT×(333/RR)0.601進行計算[10]。

1.2.5.2TDR TDR以T波波峰至T波終止的時程(Tpeak-Tend, Tp-e)計量[11]。矯正后的Tp-e用rTp-e表示，矯正公式：rTp-e= (Tp-e/QT) ×100%。

1.2.5.3電生理平衡指數 電生理學平衡指數(index of cardiac electrophysiological balance, iCEB)應用Lu等[12]實驗中采用的無創傷性方法，即iCEB=QT/QRS計算。

1.2.5.4動作電位時程 動作電位時程(action potential duration, APD)的測量是量取需進行處理的動作電位幅度(action potential amplitude, APA)，并以APA數值分別降低90%、60%、30%后所對應的復極時間段變化作為APD90、APD60、APD30，APD90-30是APD90與APD30的差值。

2 結果

2.1MTX對豚鼠離體心臟心電圖各指標的影響如Fig 1所示，與空白對照組相比，MTX加速心室復極，縮短QT/QTc間期，0.2、0.4、0.6 μmol·L-1MTX分別縮短QT間期約9%、20%、24% (P<0.05,P<0.01)；分別縮短QTc間期約7%、20%、25% (P<0.01)；MTX降低TDR，0.4、0.6 μmol·L-1MTX分別減小Tp-e約42%和22% (P<0.01,P<0.05)，0.4 μmol·L-1MTX減小rTp-e約28%(P<0.01)；MTX降低iCEB，0.2、0.4、0.6 μmol·L-1MTX分別減小iCEB約8%、19%、23% (P<0.05,P<0.01)。

2.2MTX抗E-4031所致QT間期延長等作用Fig 2結果顯示，10 nmol·L-1E-4031延長QT/QTc間期約21%/12% (P<0.01)；0.4、0.6 μmol·L-1MTX使延長的QT間期分別縮短約15%和29% (P<0.01)；0.2、0.4、0.6 μmol·L-1MTX使延長的QTc間期分別縮短約7%、13%、30% (P<0.05,P<0.01)，使增大的Tp-e分別減小約22%、19%、50% (P<0.05,P<0.01)；0.6 μmol·L-1MTX使增大的rTp-e減小約30% (P<0.01)；0.4、0.6 μmol·L-1MTX使增加的iCEB分別減小13%和27% (P<0.01)。

2.3MTX對豚鼠心室肌細胞動作電位復極時程的影響0.4、0.6 μmol·L-1MTX分別縮短APD90約17%和23% (P<0.01)；0.2、0.4、0.6 μmol·L-1MTX分別縮短APD60約7%、17%、24% (P<0.05,P<0.01)，分別縮短APD30約8%、22%、32% (P<0.05,P<0.01)。在本實驗條件下，0.4、0.6 μmol·L-1MTX可增加APD90-30(P<0.05)，使動作電位圖形趨于三角形化(Fig 3)。

2.4MTX抗E-4031誘發的動作電位復極時程延長作用如Fig 4所示，與空白對照組相比，10 nmol·L-1E-4031可明顯延長APD90(P<0.01)；0.2、0.4、0.6 μmol·L-1MTX分別使延長的APD90縮短約7%、12%、20% (P<0.05,P<0.01)。

3 討論

對于正常豚鼠離體灌流心臟，MTX縮短其QT間期，表明豚鼠心室復極速率受MTX影響而加速，MTX增加其復極儲備。考慮到在實驗研究中許多化合物還會影響RR間期和心率，所以QT間期需要根據心率的變化而進行校正。本實驗選用較為符合豚鼠心臟心率與QT間期變化關系的公式QTc=QT×(333/RR)0.601進行計算[10]。

心臟TDR是一個反映藥物抗/致心律失常特性的重要指標。心臟由心內膜下、心外膜下心室肌細胞和心室壁中層M細胞組成。這3種細胞電生理特性不同，這為TDR的發生提供了基礎。TDR增大是觸發早后除極的基礎。TDR增大表明心室肌復極離散度增大、電生理不穩定性增加，容易形成折返與傳導阻滯，從而誘發各種室性心律失常[13]。實驗結果顯示，MTX可使TDR減小，表明MTX通過加速復極，減少早后除極發生率，從而產生一定抗心律失常的作用。

Fig 1 Effects of MTX on electrophysiological index in isolated hearts of guinea pig (±s, n=6)

A: Effects of MTX on ECG waveform; B, C: Effects of MTX on QT interval; D, E: Effects of MTX on TDR; F: Effects of MTX on iCEB.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

iCEB即QT/QRS的比值，可以預測尖端扭轉型室性心動過速或非尖端扭轉型室性心動過速樣室速/室顫的發生[14]。iCEB的適當增加或減少即輕度失衡可產生抗心律失常特性，但過度改變會造成心臟電生理嚴重失衡，導致心律失常的發生。實驗結果顯示，MTX減小iCEB，表明MTX使iCEB的天平向加速復極化的方向傾斜，具備一定的扭轉藥物所致復極延遲性失衡的作用。

對于急性分離的正常豚鼠單個心室肌細胞，各濃度MTX均減短APD，即體現出加速動作電位復極的特性。另一方面，中、高濃度(0.4、0.6 μmol·L-1)MTX增大APD90-30，提示MTX尚存在著一定致心律失常特性，因為APD90-30可反映晚期復極過程，APD90-30的增大可使動作電位圖形趨向于三角形[15]，而目前研究普遍認為動作電位三角形化可預測心律失常的發生。

hERG通道阻斷劑E-4031延長QT/QTc間期，增大TDR和iCEB，延長APD，即體現出致LQT2的作用。而給予MTX可以逆轉以上指標的惡化，表明MTX可以通過縮短QT/QTc間期和APD，減小iCEB，降低TDR，從而產生抗LQT2的作用。ATP敏感性鉀電流激動劑吡那地爾增強外向電流，縮短APD和QT間期，也具有抗LQTS的作用。但是，吡那地爾縮短心室復極時增大TDR[7]，而TDR增大會引起折返和傳導阻滯，從而發生室性心律失常[13]。而MTX可以降低TDR，減少早后除極發生的可能性，因此，MTX在抗LQTS作用上可能比吡那地爾更有優勢。

Fig 2 Effects of MTX on prolonged repolarization induced by E-4031 (±s, n=6)

A: Effects of MTX on ECG waveform; B, C: Effects of MTX on prolonged QT interval; D, E: Effects of MTX on increased TDR; F: Effects of MTX on increased iCEB.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsE-4031 group.

Fig 3 Effects of MTX on APD measured in guinea pig ventricular myocytes(±s, n=6)

A: Effects of MTX on traces of action potentials; B: Effects of MTX on APD90; C: Effects of MTX on APD60; D: Effects of MTX on APD30; E: Effects of MTX on APD90-30.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 4 Effects of MTX on prolonged APD90 induced by E-4031 in guinea pig ventricular myocytes (±s, n=6)

A: Effects of MTX on traces of action potentials; B: Effects of MTX on prolonged APD90.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsE-4031 group.

總之，本實驗證實了MTX可通過縮短QT/QTc間期和APD、減小iCEB，尤其是降低TDR來逆轉E-4031導致的獲得性LQT2。另外，復極不穩定性對于預測尖端扭轉型室性心動過速/室顫的發生具有重要意義。因此，今后還將研究MTX對復極不穩定性的影響，以及能否逆轉LQTS造成的復極不穩定性增大。

[1] Viitasalo M, Oikarinen L, Swan H, et al. Effects of beta-blocker therapy on ventricular repolarization documented by 24h electrocardiography in patients with type 1 long-QT syndrome[J].JAmCollCardiol, 2006,48(4):747-53.

[2] Mizusawa Y, Horie M, Wilde A A. Genetic and clinical advances in congenital long QT syndrome[J].CircJ, 2014,78(12): 2827-33.

[3] 劉 杰, 胡大一, 劉文玲, 等. 國人II型長QT綜合征臨床特點及KCNH2基因變異[J]. 科學技術與工程, 2006,6(11): 1529-33.

[3] Liu J, Hu D Y, Liu W L, et al. Clinical characters and mutation analysis of potassium channel genes KCNH2 in 77 pedigrees of Chinese with long QT syndrome[J].SciTechnolEng, 2006,6(11):1529-33.

[4] Vandenberg J I, Perry M D, Perrin M J, et al. hERG K+channels: structure, function, and clinical significance[J].PhysiolRev, 2012,92(3):1393-478.

[5] 汪和貴, 王 森, 陳艷紅, 等. β1-AR對心衰心室肌細胞快激活延遲整流鉀電流的調控機制[J]. 中國藥理學通報, 2014,30(6):857-62.

[5] Wang H G, Wang S, Chen Y H, et al. Modulation effect of β1-adrenergic receptor on rapid component of the delayed rectifier potassium current in ventricular myocytes of chronic heart failure[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(6):857-62.

[6] 何發忠, 張 偉. HERG鉀通道與QT綜合征的藥物基因組學研究進展[J].中國藥理學通報, 2012,28(10):1337-41.

[6] He F Z, Zhang W. Research advances in pharmacogenomics of QT syndrome associated with HERG[J].ChinPharmacolBull, 2012,28(10):1337-41.

[7] Antzelevitch C, Oliva A. Amplification of spatial dispersion of repolarization underlies sudden cardiac death associated with catecholaminergic polymorphic VT, long QT, short QT and Brugada syndromes[J].JInternMed, 2006,259(1):48-58.

[8] Zeng H, Lozinskaya I M, Lin Z, et al. Mallotoxin is a novel human ether-a-go-go-related gene (hERG) potassium channel activator[J].JPharmacolExpTher, 2006,319(2):957-62.

[9] Huang M, Tang S N, Upadhyay G, et al. Rottlerin suppresses growth of human pancreatic tumors in nude mice, and pancreatic cancer cells isolated from Kras(G12D) mice[J].CancerLett, 2014,353(1):32-40.

[10] Cheng H C, Incardona J, McCullough B, et al. Isolated perfused and paced guinea pig heart to test for drug-induced changes of the QT interval[J].JPharmacolToxicolMethods, 2006,54(3):278-87.

[11] Liu T, Brown B S, Wu Y, et al. Blinded validation of the isolated arterially perfused rabbit ventricular wedge in preclinical assessment of drug-induced proarrhythmias[J].HeartRhythm, 2006,3(8):948-56.

[12] Lu H R, Yan G X, Gallacher D J. A new biomarker-index of cardiac electrophysiological balance (iCEB)-plays an important role in drug-induced cardiac arrhythmias: beyond QT-prolongation and torsades de pointes (TdPs)[J].JPharmacolToxicolMethods, 2013,68(2):250-9.

[13] Watanabe N, Kobayashi Y, Tanno K, et al. Transmural dispersion of repolarization and ventricular tachyarrhythmias [J].JElectrocardiol, 2004,37(3):191-200.

[14] Robyns T, Lu H R, Gallacher D J, et al. Evaluation of index of cardio-electrophysiological balance (iCEB) as a new biomarker for the identification of patients at increased arrhythmic risk[J].AnnNoninvasiveElectrocardiol, 2016,21(3):294-304.

[15] Tisdale J E, Overholser B R, Wroblewski H A, et al. The influence of progesterone alone and in combination with estradiol on ventricular action potential duration and triangulation in response to potassium channel inhibition[J].JCardiovascElectrophysiol, 2011,22(3): 325-31.

EffectofmallotoxinagainstLQT2inducedbyE-4031
inisolatedguineapigheartsandcardiomyocytes

PAN Ying-ying, HAN Yu, YANG Fan, YIN Yong-qiang, KANG Yi, LOU Jian-shi

(DeptofPharmacology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

AimTo investigate the effect of mallotoxin (MTX) on LQT2 induced by E-4031 in isolated guinea pig hearts and ventricular myocytes.MethodsThe isolated guinea pig heart underwent retrograde perfusion using Langendorff technique. In order to determine the effects of different concentrations of MTX on QT/QTc interval, transmural dispersion of repolarization (TDR) and index of cardiac electrophysiological balance (iCEB) in the absence and presence of hERG channel blocker E-4031, the electrocardiogram of isolated guinea pig hearts was recorded using Biopac physiological record. Single ventricular myocytes were isolated from guinea pig heart by enzymatic dissociation. Effects of MTX on action potential duration (APD) in the absence and presence of E-4031 were recorded by current clamp mode using whole patch clamp technique.ResultsMTX shortened the QT interval, reduced TDR, and decreased iCEB in isolated guinea pig heart. MTX could reverse the prolongation of QT interval and the increased TDR induced by E-4031. MTX shortened the action potential duration and decreased APD90, APD60and APD30in isolated guinea pig ventricular myocytes. MTX could reverse the prolongation of action potential repolarization duration induced by E-4031.ConclusionMTX shortens QT interval, decreases TDR, reduces iCEB, as well as shortens APD, thus reversing LQT2 induced by E-4031.

mallotoxin; LQT; hERG channel; QT interval; transmural dispersion; action potential duration

A

1001-1978(2017)11-1523-07

R-332；R284.1；R322.11；R331.31；R541.7022

時間：2017-10-10 10:05 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.020.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.010

2017-08-03,

2017-09-06

國家自然科學基金資助項目(No 81373410)；天津市自然科學基金青年基金項目(No 14JCQNJC13700)

潘瑩瑩(1992-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學，E-mail:pan_ying0701@163.com； 婁建石(1954-)，男，碩士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，Tel：022-83336860，E-mail: jianshilou@126.com