孕期尼古丁暴露加重高脂飲食所致成年子代大鼠腎上腺功能紊亂及其性別差異

段芳芳，劉 蓮，黃鶴歸，祝春燕，何 正，汪 暉,3

(1. 武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，湖北 武漢 430071；2. 湖北省荊州市長江大學醫(yī)學院藥理學系，湖北 荊州 434023；3. 發(fā)育源性疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430071)

孕期尼古丁暴露加重高脂飲食所致成年子代大鼠腎上腺功能紊亂及其性別差異

段芳芳1，劉 蓮2，黃鶴歸1，祝春燕1，何 正1，汪 暉1,3

(1. 武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，湖北 武漢 430071；2. 湖北省荊州市長江大學醫(yī)學院藥理學系，湖北 荊州 434023；3. 發(fā)育源性疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430071)

目的通過觀察孕期尼古丁暴露(PNE)所致的宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)仔鼠出生后，在高脂飲食(HFD)模型下，血中皮質(zhì)酮(CORT)濃度和腎上腺甾體合成功能的變化及其性別差異，從胰島素樣生長因子-1(IGF-1)信號通路角度探討其發(fā)生機制。方法PNE(2.0 mL·kg-1·d-1)建立大鼠IUGR模型，子代斷奶后給予HFD喂養(yǎng)直至出生后第24周。檢測仔鼠血CORT含量、腎上腺甾體合成功能、IGF-1信號通路及11β-HSDs/CR系統(tǒng)表達。結(jié)果與HFD對照組相比，PNE組♂子代血CORT濃度呈降低趨勢，♀呈升高趨勢；PNE組♂子代腎上腺甾體合成酶表達(如StAR、3β-HSD、P450c11)明顯降低，PNE組♀子代腎上腺甾體合成酶表達(如SF-1和P450c21)增加；PNE組♂子代IGF-1信號通路中IGF-1、IGF-1R升高，PNE組♀子代IGF-1信號通路各基因表達明顯增加；PNE組♂子代11β-HSD2、GR表達降低，11β-HSD1/11β-HSD2比值升高，而PNE組♀子代相應(yīng)的基因表達以增加為主。結(jié)論PNE可致HFD子代大鼠腎上腺甾體合成功能異常變化，并呈現(xiàn)較明顯的性別差異，其發(fā)生機制與尼古丁所致的腎上腺甾體合成低功能宮內(nèi)編程及出生后IGF-1介導(dǎo)的追趕性生長有關(guān)。

孕期尼古丁暴露；高脂飲食；腎上腺；性別差異；IGF1信號通路；追趕性生長

調(diào)查表明，孕婦接觸煙霧的機會相當大，在中國，15歲以上人群總吸煙率達37.6%，而非吸煙者中被動吸煙率高達63.7%[1]。流行病學調(diào)查顯示，孕期母體主動或被動吸煙可導(dǎo)致一系列子代發(fā)育相關(guān)的健康問題，包括宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)和成年后代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)發(fā)病率增高等[2-3]。尼古丁是煙草中的主要生物堿，由于其脂溶性較高，能快速通過胎盤在胎兒體內(nèi)蓄積，是煙草中危害胎兒健康的主要毒性成分。Fowden等[4]提出，胎兒時期下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)軸功能異常是IUGR胎兒成年后MS易感的可能機制之一。同時，HPA軸也與機體應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，如創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙[5]。

腎上腺作為HPA軸的終端器官，其分泌的糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GCs)對促進胎兒生長和發(fā)育有著重要意義。表達于腎上腺皮質(zhì)的胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)及IGF-1受體(IGF-1 receptor, IGF-1R)能調(diào)節(jié)組織甾體合成酶，促進GCs合成與分泌[6]。高脂飲食(high-fat diet, HFD)作為生活中常見的慢性刺激因子，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分。已證實，HFD能增強HPA軸活性和增加循環(huán)GCs水平，其發(fā)生機制與促進下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的釋放及腎上腺GCs合成有關(guān)[7]。那么，孕期尼古丁暴露(prenatal nicotine exposure, PNE)所致的IUGR仔鼠出生后在HFD下，腎上腺甾體合成功能是如何變化的？發(fā)生機制如何？這些問題至今尚未見研究報道。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器尼古丁，購自美國 Sigma-Aldrich 公司；大鼠血皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)的酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒，購自美國Assay-pro公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒，購自中國大連寶生物工程有限公司；寡聚核苷酸引物由中國上海生工生物技術(shù)有限公司合成；異氟烷，購自美國巴克斯特醫(yī)療保健有限公司；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純。Applied Biosystems StepOne實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.2實驗動物及處理大鼠由湖北省預(yù)防科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2010-2011，SPF級。動物實驗均按照中國動物福利委員會的使用原則執(zhí)行。Wistar大鼠，♀，體質(zhì)量(200±20)g；♂，體質(zhì)量(280±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每晚18 ∶00進行合籠交配(♀ ∶♂=2 ∶1)。次晨進行♀鼠陰道涂片，顯微鏡下檢見精子時記為受孕0 d(gestational day 0, GD0)。確定受孕后，將孕鼠隨機分為2組。尼古丁組于GD11開始每天皮下注射1.0 mg·kg-1，1日2次，給藥容積為1.0 mL·kg-1，直至分娩。尼古丁為液態(tài)，先溶于生理鹽水，對照組給予等量生理鹽水，給藥體積為1.0 mL·kg-1。各組孕鼠均正常飲食，直至自然生產(chǎn)。仔鼠出生后1 d時，篩選出窩仔數(shù)為8～12只的母鼠。在對照組和尼古丁組孕鼠中分別每窩挑選♂鼠和♀鼠各1只，對照組保留非IUGR仔鼠，尼古丁組保留IUGR仔鼠(仔鼠體質(zhì)量低于同胎齡鼠平均體質(zhì)量的2倍標準差)，并盡量平衡性別比例為1 ∶1。每組各挑選10只♂、♀仔鼠，最終獲得對照組♂、♀仔鼠各10只，尼古丁組♂、♀性仔鼠各10只。出生后4周(postnatal week 4，PW4)時仔鼠斷奶，♂、♀分籠，所有仔鼠均給予HFD(自由攝食)至PW24，HFD配方參考文獻[8]，包括88.0%玉米粉、11.5%豬油和0.5%膽固醇。PW24時，異氟醚麻醉后處死子代大鼠，收集大動脈血液，在4°C高速離心機下17 205×g離心15 min，留取上清液儲存于-80 ℃冰箱，待測血CORT濃度，另冰上獲取大鼠腎上腺組織，放入-80 ℃冰箱待用。

1.3血清CORT濃度的測定按照ELISA試劑盒說明書檢測血CORT濃度，其中試劑盒可檢測到的最低CORT濃度為0.39 μg·L-1，其批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.0%和7.2%。

1.4實時RT-PCR檢測腎上腺組織相關(guān)基因表達根據(jù)說明書提取腎上腺組織總RNA，通過分光光度計測定分離RNA的濃度和純度，并將其濃度調(diào)節(jié)至1 g·L-1。將總RNA儲存在焦碳酸二乙酯中，于-80℃保存。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的方案，從2 μg總RNA制備單鏈cDNA。使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，序列見Tab 1。利用提取DNA試劑盒分離相應(yīng)的RT-PCR產(chǎn)物，用于構(gòu)建以下靶基因的相對標準曲線(Tab 1)。在96孔光學反應(yīng)板中，使用ABI StepOne實時PCR熱循環(huán)儀在20 μL反應(yīng)混合物中進行PCR。為了更精確地定量檢測基因轉(zhuǎn)錄物表達水平，測量管家基因甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的mRNA表達水平，并用作定量對照。每個樣品針對GAPDH mRNA含量進行標準化。所用的PCR循環(huán)條件如下：預(yù)變性，95℃ 30 s；變性，95℃ 5 s；每個基因的退火條件列于Tab 1；延伸，72℃ 30 s，對于3β-羥類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)反應(yīng)進行延伸步驟。

Tab 1 Oligonucleotide primers and PCR conditions of rats in quantitative real-time PCR

SF-1: steroidogenic factor-1; StAR: steroidogenic acute regulatory protein; P450scc: cytochrome P450 cholesterol side chain cleavage; 3β-HSD: 3β-hydroxysteroid dehydrogenase; P450c21: steroid 21β-hydroxylase; P450c11: steroid 11β-hydroxylase; IGF-1: insulin-like growth factor-1; IGF-1R: IGF-1 receptor; Akt1: protein kinase B; 11β-HSD1: 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1; 11β-HSD2: 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2; GR: glucocorticoid receptor; MR : mineralocorticoid receptor; GAPDH : glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

2 結(jié)果

2.1血清CORT濃度變化如Fig 1所示，與HFD對照組相比，PNE組♂子代大鼠血清CORT濃度呈降低趨勢；PNE組♀子代大鼠血清CORT濃度呈增加趨勢。

Fig 1 Effects of prenatal nicotine (2 mL·kg-1·d-1) exposure on serum corticosterone (CORT) concentrationwith high-fat diet (HFD) in adult male andfemale offspring rats(±s, n=10)

2.2腎上腺甾體合成酶基因表達變化如Fig 2所示，與HFD對照組相比，PNE組♂子代腎上腺甾體合成酶系統(tǒng)mRNA表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)，其中尤以類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)、細胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450 cholesterol side chain cleavage, P450scc)、3β-HSD和類固醇11β-羥化酶(steroid 11β-hydroxylase, P450c11)明顯；在PNE組♀子代中，類固醇生成因子1(steroidogenic

Fig 2 Effects of prenatal nicotine (2 mL·kg-1·d-1) exposure on mRNA expressfactor-1, SF-1)和類固醇21β-羥化酶(steroid 21β-hydroxylase, P450c21)明顯升高(P<0.05，P<0.01)，其他無明顯改變。提示PNE組♂子代腎上腺甾體合成酶在HFD下降低，而PNE組♀子代則以升高為主。ion of adrenal steroidogenic enzymeswith HFD in adult male and female offspring rats(±s, n=10)

1: SF-1; 2: StAR; 3: P450scc; 4: 3β-HSD; 5: P450c21; 6: P450c11.*P<0.05,**P<0.01vsHFD control

2.3腎上腺IGF-1信號通路基因表達變化如Fig 3所示，與HFD對照組相比，PNE組♂子代腎上腺IGF-1信號通路中IGF-1和IGF-1R表達增加(P<0.05)；PNE組♀子代腎上腺IGF-1信號通路各基因表達明顯增加，包括IGF-1、IGF-1R、 Akt1(P<0.05，P<0.01)。提示與HFD對照組相比，PNE組♂、♀性子代大鼠在HFD下，腎上腺IGF-1信號通路表達均增加。

Fig 3 Effects of prenatal nicotine (2 mL·kg-1·d-1) exposureon mRNA expression of adrenal insulin-like growth factor-1 (IGF-1) signaling pathway with HFD in adult male andfemale offspring rats(±s, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsHFD control

2.4腎上腺11β-羥類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroiddehydrogenases,11β-HSDs)/皮質(zhì)激素受體(corticosteronereceptor,CR)系統(tǒng)基因表達變化如Fig 4所示，與HFD對照組相比，PNE組♂子代腎上腺11β-HSD2的mRNA 表達降低(P<0.05)，11β-HSD1/11β-HSD2表達比增加(P<0.05)，糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)表達水平降低(P<0.05)；PNE組♀子代腎上腺11β-HSD2的mRNA 表達降低(P<0.01)，而11β-HSD1、鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor, MR)和GR的表達均明顯增加(P<0.05，P<0.01)，11β-HSD1/11β-HSD2表達比明顯增加(P<0.01)。提示在HFD下，♂子代大鼠11β-HSDs/CR系統(tǒng)以抑制為主(主要以MR、GR為主)，♀子代腎上腺11β-HSDs/CR系統(tǒng)表達以活化為主。

Fig 4 Effects of prenatal nicotine (2 mL·kg-1·d-1) exposure on mRNA expression of adrenal 11β-hydroxysteroid dehydrogenases (11β-HSDs), mineralocorticoid receptor (MR) and glucocorticoid receptor (GR) with HFD in adult male and female offspring rats(±s, n=10)

1: 11β-HSD1; 2: 11β-HSD2; 3: 11β-HSD1/11β-HSD2; 4: MR; 5: GR.*P<0.05,**P<0.01vsHFD control

3 討論

1根普通香煙約含10 mg尼古丁[9]，本研究中，PNE組所給的尼古丁劑量(2 mL·kg-1·d-1)相當于60 kg孕婦每天抽1.8根香煙[10]，因此，可以反映日常生活中孕婦的吸煙狀況。我們前期研究證實，PNE可以導(dǎo)致子代低出生體重以及高IUGR率，同時，尼古丁可致胎腎上腺StAR和P450scc合成功能降低[11]。在細胞實驗中證實，尼古丁可以劑量依賴性地降低人胎腎上腺細胞系中甾體合成酶StAR和P450scc mRNA的表達水平，減少皮質(zhì)醇分泌[12]?？梢?，尼古丁可以影響腎上腺甾體合成酶的基因表達。

宮內(nèi)編程改變是指宮內(nèi)損傷引起的組織/器官形態(tài)和功能的持久性改變，可以從發(fā)育時期持續(xù)到成年甚至終生，導(dǎo)致成人多疾病易感性增加。本研究中，PNE組♂成年子代大鼠腎上腺類固醇合成系統(tǒng)(包括StAR、P450scc、3β-HSD、P450c11)在HFD下降低，血CORT濃度也呈現(xiàn)出降低趨勢。這些結(jié)果表明尼古丁可導(dǎo)致♂子代成年大鼠在HFD下腎上腺功能的抑制，此種抑制效果可能與宮內(nèi)編程所致的HPA軸低基礎(chǔ)活性有關(guān)。這與我們前期證實的PNE子代出生后HPA軸具有低基礎(chǔ)活性的研究結(jié)果一致[10]。本研究中，♂子代腎上腺IGF-1信號通路(包括IGF-1、IGF1-R)表達增加，呈現(xiàn)出一定的追趕性生長，上調(diào)腎上腺甾體合成酶，從而使其恢復(fù)至正常水平。而在PNE組♀子代中，血CORT水平呈現(xiàn)增加趨勢，腎上腺類固醇合成酶增加，IGF-1信號通路(IGF-1、IGF-1R、Akt1)表達比♂子代的增加更為明顯(表現(xiàn)為Akt1也增加)，呈現(xiàn)出更明顯的追趕性生長，具有一定的性別差異。

研究表明，髙血GCs增加血糖、胰島素抵抗、糖尿病以及其他代謝性疾病的風險[13]。本室研究表明，GC-IGF-1軸作為一個可能存在的負反饋軸，調(diào)節(jié)局部CORT的合成，在維持血GCs水平穩(wěn)定上起著重要作用[14]，11β-HSDs/CR系統(tǒng)基因表達是調(diào)節(jié)血GCs水平穩(wěn)定的重要因素。本研究中，與HFD對照組相比，PNE組♂、♀大鼠血CORT水平發(fā)生紊亂，呈現(xiàn)出一定的失代償，這與11β-HSDs/CR系統(tǒng)調(diào)節(jié)失代償有關(guān)，血GCs水平的穩(wěn)態(tài)一旦遭到破壞，血糖和血脂的代謝功能受到影響，導(dǎo)致子代對MS以及相關(guān)的代謝性疾病的易感性增加。

綜上，PNE所致的子代大鼠在HFD下出現(xiàn)腎上腺甾體合成功能的異常變化，其發(fā)生機制可能與尼古丁介導(dǎo)的腎上腺甾體合成低功能宮內(nèi)編程以及出生后IGF-1介導(dǎo)的追趕性生長有關(guān)。而PNE暴露和HFD下出現(xiàn)的性別差異，推測與性激素的作用有關(guān)，為此，本研究若能增加大鼠體內(nèi)性激素的檢測則能證明我們的推測。在進一步的研究中，我們將分離不同性別大鼠原代腎上腺細胞，分別給予性激素處理，檢測其甾體合成酶的基因表達，以探究性別差異。

(致謝：本實驗主要在武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系汪暉實驗室完成，感謝張酈飼養(yǎng)動物，雷有穎收取腎上腺標本。)

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Prenatalnicotineexposureaggravatedabnormaladrenalfunctionanditsgenderdifferencesinadultoffspringratswithhigh-fatdiet

DUAN Fang-fang1, LIU Lian2, HUANG He-gui1, ZHU Chun-yan1, HE Zheng1, WANG Hui1,3

(1.DeptofPharmacology,BasicMedicalCollegeofWuhanUniversity,Wuhan430071,China； 2.DeptofPharmacology,MedicalCollegeofYangtzeRiverUniversity,JingzhouHubei434023,China, 3.HubeiProvincialKeyLabofDevelopmentallyOriginatedDisease,Wuhan430071,China)

AimTo explore the alterations of blood corticosterone (CORT) level and adrenal steroidogenic function, as well as its sex specificity in intrauterine growth retardation (IUGR) rats induced by prenatal nicotine exposure (PNE) with high-fat diet (HFD) after birth, and to make clear its mechanism through insulin-like growth factor-1 (IGF-1) signaling pathway.MethodsIUGR model was established by PNE (2.0 mL·kg-1·d-1), and the offspring rats were administered with HFD until postnatal week (PW) 24 after weaning. Blood CORT concentration, adrenal steroidogenesis enzymes, expressions of IGF-1 signaling pathway and 11β-HSDs/CR system were tested.ResultsCompared with HFD control group, the CORT concentration in male offspring of PNE group represented a decrease trend, while an increase trend in female; the expressions of adrenal steroidogenesis enzymes (such as StAR, 3β-HSD and P450c11) in male offspring decreased, while increased in female offspring (such as SF-1 and P450c21); the expressions of IGF-1 signalling pathway (IGF-1 and IGF-1R) in male offspring increased, and they significantly increased in female offspring; the expression levels of 11β-HSD2 and GR decreased, but 11β-HSD1/11β-HSD2 ratio was enhanced in male PNE group, while in female PNE group, the corresponding gene expressions increased.ConclusionsPNE could induce abnormal alterations of adrenal steroidogenic function, and exhibit apparent gender differences. The potential mechanism is related to low adrenal steroidogenesis function programming induced by nicotine and catch-up growth mediated by IGF-1 after birth.

prenatal nicotine exposure; high-fat diet; adrenal; sex differences; IGF-1 signaling pathway; catch-up growth

A

1001-1978(2017)11-1530-05

R-332；R321；R322.56；R714.51；R971.91；R971.92；R977.11

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.022.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.011

2017-07-18,

2017-08-24

國家自然科學基金資助項目(No 81501269，81673524)

段芳芳(1990-)，女，碩士生，研究方向：發(fā)育源性疾病，E-mail:dff1099670109@163.com； 汪 暉(1963-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：發(fā)育源性疾病，通訊作者，E-mail:wanghui19@whu.edu.cn； 劉 蓮(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：發(fā)育源性疾病，通訊作者，E-mail: liulian@yangtzeu.edu.cn