果寡糖對水飛薊賓治療非酒精性脂肪肝的增效作用研究

李秀俠，文雪華，王燕平，吳 萍，徐寅生

(1.四川省醫學科學院四川省人民醫院城東病區藥劑科，四川 成都 610106；2. 電子科技大學醫學院，四川 成都 611731)

果寡糖對水飛薊賓治療非酒精性脂肪肝的增效作用研究

李秀俠1,2，文雪華1,2，王燕平1,2，吳 萍1,2，徐寅生1,2

(1.四川省醫學科學院四川省人民醫院城東病區藥劑科，四川 成都 610106；2. 電子科技大學醫學院，四川 成都 611731)

目的探討果寡糖(fructo-oligosaccharide，FOS)對水飛薊賓(silybin, Sil)治療非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的增效作用。方法小鼠分為正常對照組(正常飲食NCD)和模型組 (高脂飲食HFD)。于d 70，模型組隨機分為6組(n=8)：模型組，藥物干預組為Sil(30 mg·kg-1)、FOS(2 000 mg·kg-1)、Sil(30 mg·kg-1)分別與FOS高、中、低劑量聯用，每天灌胃1次，模型組給予等體積的溶媒，繼續高脂飲食，記錄小鼠的體質量和進食量。實驗d 120，檢查小鼠空腹血糖值、胰島素水平和口服葡萄糖耐受；d 130，處死動物、收集肝臟和血液，計算肝臟指數，檢測血清TG、TC、ALT、AST、肝臟組織病變。結果Sil(30 mg·kg-1)改善NAFLD小鼠血清AST、TG、TC、肝系數、空腹胰島素水平、胰島素抵抗、口服葡萄糖耐受等糖脂代謝指數，FOS(2 000 mg·kg-1)能使其治療效果變得明顯，同時降低了肝臟組織病變和脂質沉積，FOS(4 000 mg·kg-1)給藥劑量翻倍，但是增效作用無明顯優勢；而對于改善NAFLD小鼠體質量，FOS(4 000 mg·kg-1)增效作用明顯。結論益生元FOS可能通過調節腸道微生態平衡，提高Sil對NAFLD治療效果。

果寡糖；水飛薊賓；非酒精性脂肪肝；增效；高脂飲食；腸道微生物

果寡糖(fructo-oligosaccharide, FOS)又稱為低聚果糖或果聚糖，具有化學性質穩定、安全無毒、黏度大等特點，廣泛存在于3萬多種植物中，其中菊芋中含量最高，多達塊莖干重的70%～80%，商品FOS主要來源于微生物發酵。FOS分子中存在β糖苷鍵，使其不能被胃腸道酶消化吸收，作為營養基質選擇性促進雙歧桿菌等有益微生物生長。而有害微生物如沙門氏菌、大腸桿菌等，由于不能分泌果糖苷酶而使自身生長受抑，從而阻止了病原菌定植和入侵，改善了腸道微生物群，降低血清膽固醇和中性脂肪含量[1]。

研究報道，FOS能夠降低血清膽固醇含量，改善血糖值，提高動物免疫功能，促進營養物質的吸收。關于FOS的研究，長期以來一直集中在替代抗生素的優良飼料添加劑[2]。FOS是否能夠通過優化人體腸道微生物群，而用于疾病治療？越來越多的資料表明，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發生與腸道微生物失衡密切相關[3-4]，NAFLD患者腸道微生態平衡失調，有益菌(雙歧桿菌、擬桿菌、乳桿菌)明顯減少，有害菌明顯增多。因此，通過調節腸道菌群結構將成為治療該類疾病的新的重要手段之一。FOS能否優化NAFLD腸內微生態平衡治療該疾病？

對于NAFLD的治療，臨床常用調脂藥物(如他汀類、貝特類等)、護肝藥物，療效欠佳。從植物中提取有效成分，已經逐漸成為研究治療脂肪肝的新途徑[5-7]。水飛薊賓(silybin, Sil)是從水飛薊種子中提取出來的黃酮類化合物[8]，具有保護肝細胞膜、對抗自由基和脂質過氧化、增進蛋白質合成、促進損傷后肝細胞再生等作用，臨床常用于肝病的輔助治療[9]。FOS能否通過調節腸道微生物群，與Sil協同治療非酒精性脂肪肝？

高脂飲食可以誘導小鼠腸道微生態失衡[10]，本實驗通過高脂飲食構建小鼠NAFLD模型，選擇臨床上廣泛用于保護肝細胞的Sil和調節腸道菌群平衡的FOS，聯合治療NAFLD，探討FOS對Sil的增效作用。

1 材料與方法

1.1動物SPF 級♂ C57BL/6J小鼠， 8周齡，體質量19.7～21.0 g，購自四川省醫學科學院實驗動物研究所。

1.2藥品與試劑水林佳膠囊：每粒含Sil 35 mg，天津天士力制藥股份有限公司生產，批號550711182；FOS購于上海榕柏生物技術有限公司。

1.3儀器全自動生化檢測儀AU600(奧林巴斯)；超低溫保存箱(Haier)；轉輪式切片機(徠卡-2016)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；數碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業集團有限公司)等。

1.4方法

1.4.1動物分組與給藥處理 動物飼養于室溫(20 ℃～27 ℃)、相對濕度(60%～70%)、安靜的環境。70只小鼠隨機分為14籠，5只/籠。隨機選取10只小鼠作為正常對照(normal chow diet, NCD)為a組，給予普通鼠料(根據D12450B配方)；另外60只小鼠開始制備模型：給予高脂飼料，由北京華阜康生物科技有限公司配制(根據D12492配方)。于第10周末，根據文獻，體質量超過NCD組體質量20%的小鼠視作肥胖小鼠，剔除不達標的小鼠后，共計48只，隨機分組(n=8)，繼續高脂飼料飲食，b組為模型(high-fat diet, HFD)，每天給予等體積的0.5% CMC；給藥干預組包括：c組給予Sil(30 mg·kg-1)、d組給予FOS(2 000 mg·kg-1)、e組給予Sil(30 mg·kg-1)+FOS(500 mg·kg-1)，f組給予Sil(30 mg·kg-1)+FOS(2 000 mg·kg-1)，g組給予Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1)，自第10周，每天下午6點，灌胃給藥，每5 d記錄1次小鼠的體質量和進食量。給藥干預 8周后，禁食、禁水，眼球取血待做生化分析，摘取新鮮肝組織、稱重、計算肝臟指數，肝指數(liver index)/%=肝臟濕重/體質量×100%。

1.4.2小鼠空腹血糖、胰島素水平測定，胰島素抵抗指數計算 在實驗的d 120，小鼠均禁食12 h，斷尾取血，用羅氏血糖儀檢測小鼠空腹血糖值，選用小鼠胰島素檢測試劑盒(北京信諾美特)對血清胰島素進行定量，操作步驟參照試劑盒說明書。小鼠胰島素抵抗指數計算公式：

胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=空腹胰島素(FINS)mU·L-1×空腹血糖(FPG)mmol·L-1/22.5

1.4.3口服葡萄糖耐量實驗(OGTT實驗) d 120，各組小鼠禁食15 h至次晨9點，剪尾取血，用血糖儀測定血糖值，而后以3 g·kg-1葡萄糖劑量給予小鼠灌胃，分別檢測服糖后15、30、60、90、120 min血糖，繪制OGTT曲線。

1.4.4血液生化分析 取“1.4.1”中小鼠禁食過夜后，眼球取血分離而得的血清，于四川省醫學科學院/四川省人民醫院城東病區檢驗科全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平。

1.4.5肝臟病理學檢測 取部分肝臟于4%多聚甲醛固定液中固定，制作石蠟切片， HE染色、拍照并進行組織病理學評分；另取一部分肝臟于液氮中，制作冰凍切片，油紅O染色，在光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織病理學變化。

2 結果

2.1FOS聯合Sil對高脂誘導的NAFLD小鼠體質量和攝食量的影響從高脂誘導d 5開始，高脂飲食組體質量明顯比普通飼料組增高，到d 70，平均每只小鼠體質量比普通飼料組高(8.90±1.57)g。如Tab 1所示，與模型組比較，FOS(4 000 mg·kg-1)+Sil(30 mg·kg-1)給藥組，實驗的d 85(即給藥15 d后)，小鼠的體質量增加受到明顯抑制(P<0.05)，后d 105，體質量增長受到更加明顯的抑制(P<0.01)，并持續至實驗結束；FOS(2 000 mg·kg-1)+ Sil(30 mg·kg-1)給藥組，從實驗的d 105開始至實驗結束，小鼠體質量受到明顯抑制(P<0.05)。其他各給藥組小鼠體質量與模型組相比無明顯差異。

Tab 1 Effects of FOS and Sil on body weight gain(g) in mice(n=8)

After 70 days of dietary induction of obesity, chow-and HFD-fed mice were treated daily with either 0.5% CMC or Sil(30 mg·kg-1), FOS(2 000 mg·kg-1), Sil(30 mg·kg-1)+FOS(500 mg·kg-1), Sil(30 mg·kg-1)+FOS(2 000 mg·kg-1), Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1), by intragastric gavage for two months.#P<0.05,##P<0.01vsHFD group

2.2FOS聯合Sil對高脂誘導的NAFLD小鼠口服葡萄糖耐受的影響如Fig 1A、1B、1C所示，與正常對照組比較，模型組小鼠空腹血糖明顯上升(P<0.05)，胰島素水平以及胰島素抵抗指數(HOMA-IR)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，FOS(2 000 mg·kg-1)+Sil(30 mg·kg-1)給藥組，小鼠空腹血糖水平、空腹胰島素水平以及HOMA-IR均明顯降低(P<0.05)，而其他各給藥組雖有下降，但是下降不明顯。與正常對照組比較，無論空腹或是口服葡萄糖后，HFD組小鼠體內血糖值均明顯升高。由Fig 1D可看出，與HFD組比較，各給藥處理均改善了小鼠體內血糖水平，其中FOS(500 mg·kg-1)+Sil(30 mg·kg-1)、FOS(2 000 mg·kg-1)+Sil(30 mg·kg-1)和FOS(4 000 mg·kg-1)+Sil(30 mg·kg-1)處理，在口服葡萄糖120 min后，小鼠血糖值均明顯降低，與FOS(2 000 mg·kg-1)聯用組比較，FOS(4 000 mg·kg-1)聯用Sil無明顯優勢。

2.3FOS聯合Sil對高脂誘導的NAFLD小鼠血脂和酶水平的影響如Tab 2所示，與NCD組比較，HFD組小鼠血清血脂水平TC(P<0.05)、TG(P<0.01)明顯升高，除FOS(2 000 mg·kg-1)給藥組外，其他各給藥組均改善了小鼠血清血脂水平，與HFD組比較，FOS(2 000 mg·kg-1)+Sil(30 mg·kg-1)給藥組小鼠血脂水平明顯降低(P<0.05)，FOS(4 000 mg·kg-1)+Sil(30 mg·kg-1)給藥組小鼠血脂水平降低不明顯。

Fig 1 Effects of FOS and Sil on glucose-insulin homeostasis in mice with NAFLD(n=8)

A:Fasting blood glucose;B:Fasting insulin;C:HOMA-IR;D:Curve of OGTT.1:NCD;2:HFD;3:HFD+Sil(30 mg·kg-1);4:HFD+FOS(2 000 mg·kg-1);5:HFD+Sil(30 mg·kg-1)+FOS(500 mg·kg-1);6:HFD+Sil(30 mg·kg-1)+FOS(2 000 mg·kg-1);7:HFD+Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1).*P<0.05,**P<0.01vsNCD;#P<0.05,##P<0.01vsHFD

Tab 2 Effects of FOS and Sil on serum biochemical index, liver index in mice with NAFLD(n=8)

a:NCD;b:HFD;c:HFD+Sil(30 mg·kg-1); d: HFD+FOS(2 000 mg·kg-1);e: HFD+Sil(30 mg·kg-1)+FOS(500 mg·kg-1); f: HFD+Sil(30 mg·kg-1) +FOS(2 000 mg·kg-1); g:HFD+Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1).*P<0.05,**P<0.01vsNCD;#P<0.05,##P<0.01vsHFD

2.4FOS聯合Sil對高脂誘導的NAFLD小鼠血清中肝功能指標和肝系數的影響與對照組相比，模型組AST、AST水平均明顯升高(Tab 2)，差異有顯著性(P<0.01)。與模型組相比，Sil(30 mg·kg-1)+FOS(2 000 mg·kg-1)和Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1)干預組小鼠血清AST含量明顯下降(P<0.01)，ALT水平也下降，但差異無顯著性；其他各給藥組均改善了小鼠血清轉氨酶水平，但是差異不明顯。在肝指數方面，HFD小鼠比NCD組明顯增加(P<0.05)，各給藥組小鼠均較模型組明顯下降(P<0.05)，其中Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1)給藥組下降最明顯(P<0.01)。

2.5FOS聯合Sil對高脂誘導的NAFLD小鼠肝組織病理學的影響小鼠肝臟組織經HE染色后，鏡下觀察(Fig 2A)，正常飼料組(NCD)肝細胞結構完整，排列整齊，肝小葉清晰可見。HFD組小鼠肝臟組織結構紊亂，肝小葉分界不清、肝細胞體積增大、腫脹，胞質內可見較大的空泡。經藥物干預后，各組小鼠肝組織炎癥反應均有所減輕，各組小鼠肝臟仍然可見一定程度的肝細胞脂肪變，與FOS(2 000 mg·kg-1)、Sil(30 mg·kg-1)給藥組比較，FOS(500 mg·kg-1)+Sil(30 mg·kg-1)組小鼠肝臟組織病變程度并未減輕，而Sil(30 mg·kg-1)+FOS(2 000 mg·kg-1)和Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1)給藥組，小鼠肝細胞數量增加，排列趨向整齊，脂肪變性改善，但是組織病理學評分顯示，各給藥組與HFD組比較差異無顯著性。油紅O染色分析顯示(Fig 2B)，與正常組比較，HFD組小鼠肝臟組織存在大量紅染油滴，各給藥組小鼠肝組織內脂滴均有所減少，其中Sil(30 mg·kg-1)+FOS(2 000 mg·kg-1)和Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1)給藥組，小鼠肝臟組織病變緩解最明顯。

3 討論

關于NAFLD的發病機制，尚不十分清晰，目前已知的主要發病機制是“二次打擊”學說[11]，初次打擊是指脂質代謝紊亂和胰島素抵抗導致脂質沉積于肝細胞，形成單純性脂肪肝；二次打擊主要指脂質過氧化損傷、各種原因所致的氧化應激引起NAFLD，進展為脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化。Sil能夠清除氧自由基、保護細胞內酶系統、穩定細胞膜，從而保護肝細胞、改善肝功能，其作用機制遵守了“二次打擊”學說。

腸道菌群與肥胖的關系是近年來研究的熱點之一[12]。越來越多的研究表明，高脂飲食能夠導致人類腸道微生物群結構失衡，從而引發各種代謝性疾病，包括NAFLD、糖尿病、高血壓等[10,13]。本實驗通過高脂飲食誘導小鼠腸道微生物群紊亂，進而導致肥胖和NAFLD，選擇益生元FOS優化NAFLD小鼠腸道微生物群，同時利用Sil對肝臟的保護作用，研究FOS對Sil治療高脂誘導NAFLD的增效作用。

高脂誘導過程中HFD小鼠體質量不斷增加，Sil(30 mg·kg-1)與高劑量的FOS(4 000 mg·kg-1)聯用時，對Sil肥胖小鼠體質量改善作用最明顯。各給藥處理組均明顯改善了小鼠肝指數，小鼠肝臟組織病理學結果顯示，對于Sil(30 mg·kg-1)抑制肝組織脂肪沉積作用，FOS(2 000、 4 000 mg·kg-1)均具有明顯的增效作用。

中劑量的FOS與Sil(30 mg·kg-1)聯用時，明顯降低了小鼠血脂水平(P<0.05)，而高劑量的FOS與Sil(30 mg·kg-1)聯用時對小鼠血脂水平無明顯改善。中、高劑量的FOS與Sil聯用時均明顯降低了血清AST含量，與中劑量聯用組比較，FOS高劑量聯用處理對小鼠AST的改善無明顯優勢；其他各處理均對小鼠血脂水平、AST無明顯改善作用。中劑量 FOS聯用組小鼠空腹血糖、空腹胰島素水平、HOMA-IR以及小鼠血糖清除能力得到明顯改善；而高劑量 FOS聯用組，僅小鼠血糖清除能力得到明顯改善；除低劑量FOS聯用處理明顯改善了小鼠血糖清除能力外，其他各給藥處理組對小鼠體內糖代謝能力均無明顯改善。說明中、高劑量FOS對Sil改善NAFLD血脂以及AST均具有明顯的增效作用，且中劑量的作用效果好于高劑量。同時，對于Sil改善NAFLD小鼠體內糖代謝，FOS(2 000 mg·kg-1)增效作用最明顯，FOS(4 000 mg·kg-1)次之。為何中劑量FOS增效作用好于高劑量FOS呢？我們推測在給予益生元時(低、中、高劑量)，寄主體內益生菌開始繁殖，腸道微生態趨于平衡，而繼續增加益生元給藥量可能導致益生菌大量繁殖，原本趨于平衡的腸道微生態發生變化，反而不利于疾病的恢復。

Fig2HepatichistopathologyinmicefromdifferentgroupsA: Effects of FOS and Sil on tissue morphology of liver(HE staining, ×400); B: Effects of FOS and Sil on lipid accumulation of liver(ORO staining, ×400).1:NCD;2:HFD;3:HFD+Sil(30 mg·kg-1);4:HFD+FOS(2 000 mg·kg-1);5:HFD+Sil(30 mg·kg-1)+FOS(500 mg·kg-1);6:HFD+Sil(30 mg·kg-1)+FOS(2 000 mg·kg-1);7:HFD+Sil(30 mg·kg-1)+FOS(4 000 mg·kg-1).*P<0.05,**P<0.01vsNCD

AST和 ALT是反映肝損害的敏感指標，ALT位于肝細胞質內，而AST位于肝細胞質和線粒體內，正常情況下AST較ALT稍高。當肝細胞輕度病變時， ALT上升幅度較AST大，比值降低；肝炎恢復期，比值逐漸上升至正常；肝細胞嚴重損害時，血清AST升高幅度較ALT為大，比值繼續增加。本研究發現， FOS與Sil聯用時，對AST的作用大于對ALT的作用。因此，Sil聯合FOS對血清AST改善效果好于ALT水平，可能與小鼠肝臟病變程度有關。

FOS(2 000 mg·kg-1)單獨用于治療NAFLD未發現具有臨床意義的療效，但是與Sil合用時提高了其療效，那么除了能夠保護肝臟細胞和酶系統，Sil是否也影響腸道微生物群，從而與FOS協同治療NAFLD？有報道，益生元與益生菌組合起來的合生元，能夠有效治療NAFLD[14]，Sil是否能夠抑制有害菌或者促進有益菌生長？如果進一步添加了益生菌，FOS的作用是否更加明顯?有待于進一步的機制研究。

綜上所述，FOS(2 000、4 000 mg·kg-1)對Sil治療NAFLD均具有一定的增效作用。由于FOS (4 000 mg·kg-1)給藥劑量翻倍，但是增效作用并未明顯增加，因此，對于改善NAFLD小鼠體內糖脂代謝，FOS(2 000 mg·kg-1)對Sil(30 mg·kg-1)增效作用更具有經濟性、有效性和可行性。FOS聯合Sil治療NAFLD的臨床意義有待進一步探討。

(致謝：本實驗于四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗室完成，感謝實驗室所提供的幫助與支持。)

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Modulationoffructo-oligosaccharideduringsilybin-meditatedimprovementofnonalcoholicfattyliver

LI Xiu-xia1,2, WEN Xue-hua1,2,WANG Yan-ping1,2, WU Ping1,2, XU Yin-sheng1,2

(1.DeptofPharmacy,EastBranchofSichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610106,China; 2.SchoolofMedicine,UniversityofElectonicScienceandTechnologyofChina,Chengdu611731,China)

AimTo examine weather fructo-oligosaccharides(FOS) and silybin(Sil) could exhibit synergetic effect on treating obesity-associated non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).MethodsSeventy mice were randomly divided into two groups: control group(NCD, fed with normal chow diet), the other sixty mice were fed with high-fat diet (HFD) to establish NAFLD model. Seventy days after the establishment of experimental model, the latter group was then randomly subdivided into six groups: model(HFD), Sil(30 mg·kg-1), FOS(2 000 mg·kg-1), Sil(30 mg·kg-1) combined with FOS of high, medium and low dose respectively. The NCD and HFD group were given 0.5% CMC, and the other groups were fed with high-fat diet and given 10 mL·kg-1by gavage daily, then body weight and food intake were recorded. Fasting blood glucose, insulin, homeostasis model of assessment for insulin resistence index(HOMA-IR) and oral glucose tolerance tests(OGTT) were measured after 120 days. All mice were sacrificed after 130 days, and blood and liver were collected. Levels of TC, TG, ALT, AST in serum were detected, and liver index and pathology were also examined.ResultsFOS(2 000 mg·kg-1) showed obvious synergism for Sil-mediated attenuation of levels of TC, TG, ALT, AST in serum, fasting blood glucose, insulin, HOMA-IR, OGTT curve, liver index and pathology, but FOS(4 000 mg·kg-1) could not bring superiority with a double dose, except for its improvement in body weight of mice with NAFLD.ConclusionsIn the treatment of NAFLD, FOS exhibits synergetic effect with Sil. This agent might be a potent candidate for obesity and NAFLD prevention, through modulating the composition of gut microbiota.

fructo-oligosaccharide; silybin; non-alcoholic fatty liver disease; synergetic effect; high-fat diet; gut microbiota

A

1001-1978(2017)11-1535-07

R-332；R322.47；R343.3；R575.5；R975.505；R977.6

時間：2017-10-10 10:05 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.024.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.012

2017-07-18,

2017-08-25

國家自然科學基金資助項目(No 81402987)

李秀俠(1981-)，女，博士，主管藥師，助理研究員，研究方向：藥理學，通訊作者，E-mail: lxx_0824@163.com