依普利酮基于阻斷Kv1.3通道對抗Treg細胞體外促成纖維細胞增殖作用

邵培培, 徐 琦, 李少華, 程路峰

(新疆醫科大學基礎醫學院1. 藥理學教研室、2. 免疫學教研室, 新疆 烏魯木齊 830011)

依普利酮基于阻斷Kv1.3通道對抗Treg細胞體外促成纖維細胞增殖作用

邵培培1, 徐 琦2, 李少華1, 程路峰1

(新疆醫科大學基礎醫學院1. 藥理學教研室、2. 免疫學教研室, 新疆 烏魯木齊 830011)

目的SD乳鼠心肌成纖維細胞(CFs)和成年SD大鼠脾臟調節性T細胞(Tregs)體外共培養，探討二者相互作用，并觀察依普利酮(EPL)對其的影響。方法免疫磁珠法分選大鼠Tregs，差速貼壁法分選大鼠CFs，分為CFs、CFs + Tregs、CFs + Tregs + EPL(30 μmol·L-1)、Tregs組。孵育后，CCK-8法檢測CFs的增殖情況；ELISA法檢測CFs分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)的蛋白相對表達水平；RT-qPCR檢測Tregs的Kv1.3、KCa3.1、CRAC通道mRNA的相對表達水平；In-Cell Western blot法檢測Tregs的Kv1.3通道蛋白質的表達水平。結果共培養48 h后，CFs增殖趨穩，共培養組CFs增殖明顯(P<0.01)，EPL可明顯抑制其增殖(P<0.01)；CFs分泌的Ⅰ型、Ⅲ型膠原和MMP-2的相對表達水平均明顯增加(P<0.01)，EPL可明顯抑制其增加(P<0.01)；Tregs的Kv1.3、KCa3.1、CRAC通道mRNA的相對表達水平分別增加6.95、1.99、1.53倍(CFs+TregsvsTregs，P<0.01)，EPL明顯抑制Kv1.3、KCa3.1 mRNA的表達(CFs + Tregs + EPLvsCFs + Tregs，P<0.01)，其中Kv1.3通道的抑制最為明顯；Tregs的Kv1.3通道蛋白增加了67.9%(CFs +TregsvsTregs，P<0.01)，EPL可明顯抑制其表達(P<0.01)。結論體外Treg與CFs共培養48 h后，Tregs能明顯促進CFs的增殖，EPL可以通過下調Tregs細胞膜上Kv1.3通道的表達，抑制Tregs的活化/增殖，間接抑制心肌纖維化。

心肌纖維化；CFs；共培養；CD4+CD25+Tregs；依普利酮；Kv1.3通道；增殖

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)以心肌正常組織結構中細胞增殖、細胞外基質(extracellular matrix, ECM)過度沉積為主要表現[1]，是多種心臟疾病發展至一定階段所共有的病理改變，也是引起心室重塑致心力衰竭的關鍵原因。醛固酮(aldosterone, ALD)已被證實可以通過多種信號通路致心、腎等器官的纖維化[2]。其能促進轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)等的表達，刺激多種細胞向纖維母細胞的轉化及減少基質金屬蛋白酶等的合成，促纖維化[3]。炎癥反應在心血管疾病進展中越來越受到關注。研究顯示[4]，多種免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cell，DC)、T細胞、B細胞等均存在醛固酮受體，當其被激動后，會引起多種細胞因子分泌而促進纖維化。調節性T淋巴細胞(regulatory T lymphocytes, Tregs)是近年來發現的抗炎作用細胞，其功能增強被認為可以抑制炎癥反應[5]。目前，Treg細胞對心肌纖維化的作用并不清楚。T淋巴細胞的活化/增殖受其膜上的Kv1.3通道的活化調控。前期研究表明[6]，慢性心衰大鼠Treg細胞膜上的Kv1.3通道活性增強，推測心衰時Tregs活化/增殖，且給予第2代ALD受體拮抗劑依普利酮(eplerenone, EPL)后，該通道活性明顯下調[7]。為進一步闡明Tregs在心肌纖維化進程中的作用，本研究擬建立大鼠Tregs與心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts, CFs)體外共培養模型，評價CFs的變化情況，測定Tregs上Kv1.3等離子通道的改變，并分析探討EPL對兩者的干預機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 15周的♂ SD大鼠(新疆醫科大學實驗動物中心)，體質量250～300 g。剛出生的SD乳鼠，母鼠喂養3 d。

1.1.2試劑 大鼠Ⅰ型膠原、大鼠Ⅲ型膠原、大鼠基質金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2, MMP-2)ELISA檢測試劑盒，購自武漢華美生物技術公司；生物素標記的小鼠抗兔CD4 (BD 554836)、 PE標記的小鼠抗兔CD25 (BD 554866)，購自美國BD公司；大鼠淋巴細胞分離液(LTS1083，Sigma)；胎牛血清、RPMI 1640培養基(Hyclone)；SYBRTMSelect Master Mix(Life Technologies)；小鼠抗大鼠KCNN1.3一抗(ab105562)、β-actin(ab8226)，購自Abcam公司；IRDye?800CW Goat anti-mouse(LI-COR Biosciences)等。

1.1.3儀器 DOY-CLX Odyssey雙色紅外激光成像系統(美國LI-COR公司)；HF240二氧化碳培養箱(香港Heal Force?公司)；KDC-40離心機(中科中佳科學儀器有限公司)；ZHWY-200D恒溫培養振蕩器(上海智成分析儀器制造有限公司)；免疫磁珠分選儀MACS(德國Miltenyi)。

1.2方法

1.2.1Tregs細胞的分選及體外培養 免疫磁珠法分選正常SD大鼠脾臟CD4+CD25+Tregs(詳見相關試劑操作說明書)，陽性分選得到Tregs，進行細胞計數及存活率統計。用含10 g·L-1牛血清、rmIL-2(10 mg·L-1)、TGF-β1(2 mg·L-1)、雙抗(2 mg·L-1)、anti-CD3(10 mg·L-1)及HSP60(10 mg·L-1)的完全培養基，于37℃、5% CO2孵育48 h待用，本法所得Tregs純度≥95%。

1.2.2SD大鼠乳鼠心肌成纖維細胞的分選 取新生SD乳鼠10只，胰酶、Ⅱ型膠原酶依次消化分離心肌組織。通過2次差速貼壁分離法收集、培養乳鼠CFs，應用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5% CO2培養箱中孵育。

1.2.3EPL的濃度對Tregs增殖的抑制作用和共培養的時間對CFs增殖的影響

1.2.3.1EPL對Tregs和CFs增殖的抑制作用 設置EPL梯度濃度(0、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μmol·L-1)，分別與Tregs或CFs培養48 h后，給予CCK-8試劑檢測。抑制率/%=[(A空白對照-AEPL處理組)/A空白對照]×100%。

1.2.3.2共培養時間對CFs增殖的影響 CCK-8法檢測Tregs共培養不同時間(0、12、24、36、48、60 h)對CFs增殖的影響。將各組的細胞懸液吸出，用PBS沖洗，每孔加CCK-8試劑后檢測。

1.2.4CFs與Tregs體外共培養 接種104個CFs于96孔板中，置于37℃、5% CO2孵育箱中適應性培養48 h，貼壁率達到(80.0±5.0)%時，換PBS空白培養基饑餓培養12 h，同時對Tregs饑餓處理，各組在含有10 g·L-1牛血清、雙抗(2 mg·L-1)的RPMI 1640培養基中，于37℃、5% CO2孵育箱中培養48 h。

1.2.5ECM相關蛋白表達的檢測 將CFs、CFs+Tregs、CFs+Tregs+EPL 3組細胞于37℃、5% CO2孵育箱中培養48 h后，分別收集培養基，使用ELISA試劑盒檢測CFs分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2的相對含量。

1.2.6Tregs細胞中mRNA的表達檢測 RT-qPCR檢測Tregs細胞的Kv1.3、KCa3.1、CRAC通路基因的表達。收集各組的Tregs，分別提取各組RNA并檢測其濃度和純度，立即進行逆轉錄以防RNA裂解(詳細步驟見Thermo Reverse Translation Kit產品的操作說明書)。使用Life SYBR?Green Master Mix 試劑盒進行PCR擴增，于冰上配擴增體系(H2O 6.4 μL，SYBR 10 μL，Primer 0.8 μL)，加樣品2.0 μL。設定擴增程序Cycle1(1)50.0℃，2 min；Cycle2(1)95.0℃，2 min；Cycle3(40)95.0℃，15 s，60℃，15 s；Cycle4(1)60℃，15 s；Cycle5(1)95℃，15 s。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Gene sequences of ion channels

1.2.7Treg細胞Kv1.3通道蛋白表達的檢測 將Tregs懸液布于U型黑壁96孔板中，多聚甲醛固定后，用封閉液(0.5 g·L-1脫脂奶粉配制)封閉1 h，加50 μL KCNN1.3一抗(用0.25 g·L-1脫脂奶粉1:800稀釋)，于搖床上4℃、30 r·h-1過夜，次日加二抗，孵育后，用Odyssey的700和800通道掃描孔板，中等掃描質量，169 μm的分辨率，3.0 mm焦距，亮度為5進行上機檢測。

1.2.8統計學分析 運用SPSS 22.0軟件對數據進行分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1EPL對Tregs和CFs增殖的抑制作用及共培養時間對CFs增殖的影響

2.1.1EPL對Tregs和CFs增殖的抑制作用 如Fig 1所示，Tregs給予EPL(0.1、0.3、1、3、10、30、100 μmol·L-1) 48 h后，當EPL濃度在0～100 μmol·L-1時，抑制率隨EPL濃度的增加而升高，30 μmol·L-1的EPL對Tregs增殖的抑制率達到82.16%，之后趨于穩定，此濃度下藥物抑制率接近最大。給予EPL(0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 μmol·L-1) 48 h后，CCK-8法檢測CFs的增殖。Fig 2結果顯示，當EPL濃度在0～300 μmol·L-1時，抑制率隨EPL濃度的增加而升高，當EPL的濃度為30 μmol·L-1時，其對CFs增殖的抑制率可達17.17%，之后趨于穩定。基于此，后續實驗選擇EPL 30 μmol·L-1作為受試檢測濃度。

2.1.2EPL抑制共培養促進的CFs增殖 CFs在共培養體系下，細胞增殖明顯增加，當向共培養體系中加入EPL(30 μmol·L-1)后，CFs的增殖明顯下降。通過CCK-8法檢測得Tregs細胞和CFs共培養48 h時達到增殖的平臺期，共培養48 h后，CFs+Tregs組的CFs的增殖率為260.35%(CFs+TregsvsCFs，P<0.01)；EPL對CFs的抑制率為59.43%(CFs+Tregs+EPLvsCFs+Tregs，P<0.01)，見Tab 2。

Fig 1 Different concentrations of EPL incubated Tregs for48 hours with different inhibitory rate curve of Tregs proliferation

Fig 2 Different concentrations of EPL incubated CFs for 48hours with different inhibitory rate curve of CFs proliferation

2.2EPL抑制共培養的CFs的ECM分泌ELISA檢測結果表明，體系環境中CFs Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2的表達分別增加了2.34、2.46、2.57倍(CFs+TregsvsCFs，P<0.01)。在培養體系中加入EPL后，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和MMP-2的表達被抑制了33.92%、47.97%、62.15%(CFs+Tregs+EPLvsCFs+Tregs，P<0.01)，見Tab 3。

Tab 2 Effect of co-cultured time of CFs proliferation(±s，n=8)

**P<0.01vsCFs;##P<0.01vsCFs+Tregs

2.3EPL抑制共培養的Tregs中Kv1.3、KCa3.1、CRAC通道的mRNA增加共培養處理后，Tregs細胞的Kv1.3、KCa3.1、鈣釋放激活Ca2+(Ca2+release-activated Ca2+，CRAC)通道的mRNA表達分別增長了6.95、1.99、1.53倍(CFs+TregsvsTregs，P<0.01)；EPL對Kv1.3通道和KCa3.1通道mRNA表達的抑制率為79.28%、82.14%(CFs+Tregs+EPLvsCFs+Tregs，P<0.01)，對CRAC通道mRNA的相對表達抑制率無統計學意義(P>0.05)，見Fig 3。

Fig 3 Relative expression level of mRNA in Tregs of different groups

**P<0.01vsTregs group;##P<0.01vsCFs+Tregs group

Tab 3 Collagen type Ⅰ, collagen type Ⅲ, MMP-2 secreted by CFs under co-culture system(±s, n=8)

**P<0.01vsCFs group;##P<0.01vsCFs+Tregs group

2.4EPL抑制共培養后Kv1.3通道蛋白的表達增高In-Cell Western blot法檢測各組Tregs細胞中Kv1.3通道蛋白的相對表達水平。共培養后，Kv1.3通道蛋白的相對表達水平增加32.05%(P<0.01)；EPL能抑制其表達45.68%(P<0.01)，見Fig 4。

3 討論

心肌纖維化是慢性心衰進展過程中重要的病理表現[8]，它與高血壓、心肌梗死、病毒性心肌炎、動脈粥樣硬化等多種疾病的病理過程有著密切聯系，還可導致心律失常和心源性猝死等嚴重并發癥，故預防和逆轉心肌纖維化是臨床治療心力衰竭的關鍵點之一[9]。心肌纖維化的發病機制至今尚未明確，有觀點認為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)的激活是引起心肌纖維化的關鍵[10]。臨床上，運用較為廣泛的心衰治療藥物是血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEI)類，其對心衰時ALD的釋放具有明顯的負調控作用[11]。但實驗證明，臨床上持續應用ACEI至后期，機體對醛固酮的抑制作用會明顯降低，即出現了“ALD逃逸”[12]。因此，現今醛固酮受體拮抗劑在心衰的治療上引起了較大重視。依普利酮是第2代ALD受體拮抗劑，在臨床上應用于慢性心衰的治療，具有選擇性高、毒副作用小的特點。前期研究結果顯示[6]，心衰8周以上的大鼠Tregs的Kv1.3通道電流密度明顯增強(是空白組的3～4倍)，而ALD受體拮抗劑EPL(30 μmol·L-1)可明顯降低Tregs的Kv1.3電流(P<0.01)；同樣的結果在心衰患者的Tregs中表現更為突出(Kv1.3電流密度為健康人的4～5倍)。提示心衰后期Tregs處于活化增殖狀態，并可被依普利酮所抑制。

Fig 4 Relative Kv1.3 channel proteinexpression level in different groups

**P<0.01vsTregs group;##P<0.01vsCFs+Tregs group

調節性T細胞是免疫反應和炎癥作用平衡中的關鍵因素[13]。早在1995年，Sakaguchi等[13]就在研究中發現，成年鼠中近10%的外周CD4+T細胞可表達IL-2受體α鏈CD25的信號表征，去除這群細胞會引起大鼠產生多種自身免疫性疾病，而再次回輸該細胞就能阻止疾病的發生。機體免疫系統激活，即免疫調節失衡，則分泌大量的炎癥因子，多有報道炎癥因子可直接或間接引起心肌纖維化[14]。

本研究的結果表明，EPL對Tregs與CFs共培養48 h時CFs的增殖被抑制趨于穩定；本實驗中30 μmol·L-1EPL對Tregs增殖的抑制率可達到82.16%，對CFs增殖的抑制率為17.17%，可見同一濃度下的EPL對兩種細胞抑制作用差別很大，推測EPL對Tregs的抑制作用可能是間接引起CFs增殖被抑制的主要原因。在共培養體系中，CFs合成的Ⅰ型、Ⅲ型膠原和MMP-2的相對表達量均明顯增加，給予EPL后，這3種蛋白的相對表達量均明顯減少。說明Tregs可促進心肌纖維化，EPL則可能部分通過抑制Tregs的活化/增殖，抑制心肌纖維化進程。

目前，被廣泛認可的T細胞活化的信號通路調控為Kv1.3通道維持T淋巴細胞的靜息電位，使T細胞處于能被活化的狀態；T淋巴細胞被活化后，KCa3.1通道作為Ca2+激活的鉀離子通道會使膜電位超極化，使得Ca2+持續內流，促使CRAC通道打開，上調內質網的鈣庫釋放Ca2+的量，Ca2+內流增加可通過鈣依賴性的蛋白激酶通路啟動各種細胞因子的轉錄，使其發揮免疫效能。本研究結果顯示，CFs+Tregs組的Kv1.3、KCa3.1、CRAC 3種離子通道mRNA的表達較Tregs組均有明顯增加，給予EPL后，Kv1.3及KCa3.1通道mRNA的表達明顯降低，而CRAC通道的降低趨勢差異無統計學意義。Varga等[15]在多發性硬化患者的Tregs上發現Kv1.3通道含量較少。Estes等[16]利用高通量定量方法分析了人初始淋巴細胞的K+通道功能性活動的實驗結果，提示Kv1.3通道的活性可作為T細胞的功能活性標志物。基于Kv1.3通道mRNA的研究結果及Kv1.3通道在免疫疾病中靶標的地位，故主要選擇對Kv1.3通道蛋白的相對表達水平進行了檢測。ICW的結果顯示，CFs+Tregs培養體系中，Tregs膜上Kv1.3通道蛋白的表達較Tregs組明顯增加，給予EPL后，該通道蛋白的表達被明顯抑制。

以上研究結果在mRNA和蛋白的層面上驗證了Kv1.3通道在Tregs細胞活化/增殖過程中發揮了重要作用。Tregs上Kv1.3通道的高表達引起Tregs的活化/增殖，進而促進了CFs的增殖，而依普利酮對Kv1.3通道的抑制作用能間接引起CFs的增殖被抑制，雖然依普利酮也能夠直接抑制CFs的增殖，但此作用明顯弱于間接抑制作用。依普利酮對Kv1.3通道的作用為直接作用還是由于其通過抑制醛固酮受體后的間接作用，仍需進一步研究證實。

(致謝：本實驗在新疆醫科大學第一附屬醫院科技樓5樓共享實驗平臺完成，感謝實驗平臺支持和指導老師的悉心幫助。)

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Antagonizationofeplerenoneonproliferationofcardiacfibroblastsinducedbyco-culturedTregcellsbasedoninhibitionofKv1.3channelofTregs

SHAO Pei-pei1, XU Qi2, LI Shao-hua1, CHENG Lu-feng1

(1.DeptofPharmacology, 2.DeptofImmunology,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

AimTo establish a co-incubation system in cardiac fibroblasts of SD neonatal rats and spleen CD4+CD25+regulatory T lymphocytes (Tregs) of normal adult SD rats, and to investigate the effects of eplerenone(EPL) on the interaction of two cells and the relationship with the Kv1.3 channel on Tregs cell membrane.MethodsThe spleen Tregs of normal adult SD rats were sorted by immunomagnetic bead sorting, and the myocardial fibroblasts of SD rats were isolated by differential adherence method. The experiment was conducted in the following groups: CFs, CFs+Tregs, CFs+ Tregs+EPL, Tregs. The proliferation of CFs was detected by CCK-8 method. The expression levels of typeⅠcollagen, typeⅢcollagen and matrix metalloproteinase 2(MMP-2) secreted by CFs were detected by ELISA. The mRNA expression levels of Kv1.3, KCa3.1 on Tregs cell membrane and intracellular CRAC channel were detected by RT-qPCR technique. Tregs cell membrane Kv1.3 channel protein expression levels were determined by In-Cell Western blot.ResultsAfter 48 h incubation of the co-culture system, the cell proliferation was stable. CFs proliferation was marked(P<0.01), which could be inhibited by EPL(P<0.01). The type I, type III collagen and MMP-2 secreted by CFs increased (P<0.01). The expression levels of Kv1.3, KCa3.1 and CRAC channel mRNA in Tregs increased by 6.95, 1.99 and 1.53 fold (CFs + TregsvsTregs,P<0.01), EPL decreased the mRNA level of each channel (CFs + Tregs + EPLvsCFs + Tregs,P<0.01), and the decrease of Kv1.3 channel was the most significant (P<0.01). The Kv1.3 channel protein of Tregs increased by 67.9% (CFs + TregsvsTregs,P<0.01), which could be inhibited by EPL(P< 0.01).ConclusionsTregs cultured with CFs after 48 h can significantly promote the proliferation of CFs, and EPL can down-regulate the Kv1.3 channel expression on the Tregs membrane and inhibit the activation/proliferation of Tregs, indirectly inhibiting myocardial fibrosis.

myocardial fibrosis; CFs; co-incubation; CD4+CD25+Tregs; eplerenone; Kv1.3 channel; proliferation

A

1001-1978(2017)11-1558-06

R-322；R329.24；R331.125；R392.12；；R542.230.22

時間：2017-10-10 10:05 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.032.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.016

2017-07-06,

2017-08-01

國家自然科學基金資助項目(No 81360491)；新疆自治區高等學校科研計劃重點項目(No XJEDU2013I22)

邵培培(1993-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學，E-mail：sp6999cm@163.com； 程路峰(1975-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學、分子免疫學，通訊作者，E-mail：lewis_clf@163.com