紅景天苷通過(guò)抑制補(bǔ)體C3的表達(dá)對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)NeuN、Egr4影響的研究

宋百穎，賴(lài)文芳，蘇燕青，林 昱，許 文，洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

紅景天苷通過(guò)抑制補(bǔ)體C3的表達(dá)對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)NeuN、Egr4影響的研究

宋百穎，賴(lài)文芳，蘇燕青，林 昱，許 文，洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

目的探討紅景天苷(Sal)通過(guò)抑制補(bǔ)體C3對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)NeuN、Egr4的影響。方法♂成年SD大鼠45只隨機(jī)分成假手術(shù)組(sham)、模型組(MCAO)以及給藥組(MCAO+Sal)，采用線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。連續(xù)給藥1、2 d，免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測(cè)NeuN、Egr4、C3和C1的表達(dá)情況。健康成年♂ SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，即人工腦脊液+sham、C3aR抑制劑+sham、人工腦脊液+MCAO、C3aR抑制劑+MCAO、人工腦脊液+MCAO+Sal、C3aR抑制劑+MCAO+Sal，Western blot技術(shù)檢測(cè)缺血側(cè)腦組織NeuN、Egr4、C3的表達(dá)水平。結(jié)果與MCAO組相比較，經(jīng)紅景天苷分別作用1、2 d能使C3的表達(dá)明顯下降，NeuN表達(dá)明顯上升；紅景天苷給藥1 d對(duì)Egr4和C1沒(méi)有明顯影響，但能使2 d的Egr4表達(dá)明顯升高， C1的表達(dá)明顯降低；經(jīng)連續(xù)2 d側(cè)腦室注射C3aR抑制劑或給予紅景天苷后，均能夠降低P50的表達(dá)，增加Egr4的表達(dá)。結(jié)論紅景天苷對(duì)腦缺血/再灌注亞急性期的神經(jīng)保護(hù)功能可能與抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活，調(diào)控Egrs，從而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。

紅景天苷；腦缺血/再灌注；補(bǔ)體C3；C3aR抑制劑；Egrs；神經(jīng)保護(hù)

腦卒中的致死率在西方工業(yè)國(guó)家位列第3，僅次于惡性腫瘤和心血管疾病。在我國(guó)的致死性疾病中位居第2，且發(fā)病率正在逐年上升。補(bǔ)體系統(tǒng)是人體免疫系統(tǒng)重要的組成部分，廣泛參與機(jī)體的微生物防御的免疫反應(yīng)。補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，使得腦損傷加重[1-2]。因此，適當(dāng)抑制補(bǔ)體系統(tǒng)有利于減輕腦損傷的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。

紅景天(RhodiolaroseaL.)為景天科植物，其藥用歷史悠久，紅景天苷(salidroside, Sal)是紅景天有效成分之一，也是紅景天的藥用基礎(chǔ)，具有保護(hù)神經(jīng)、清除自由基、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)等功效[3]。研究表明[4]，紅景天苷能有效減少缺血性腦損傷大鼠的大腦梗死體積以及改善神經(jīng)損傷[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)在紅景天苷對(duì)腦缺血/再灌注大鼠保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，著重分析紅景天苷在腦缺血/再灌注大鼠模型中對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)C3的作用。

1 材料

1.1藥品與試劑紅景天苷(由福建中醫(yī)藥大學(xué)提供，純度≥98%)；DAPI染色液(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：C1005)；神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron specific nuclear protein, NeuN)抗體(Abcam，貨號(hào)：ab104224)；C3抗體(生工生物工程上海有限公司，貨號(hào)：AB51005)；C3a抗體(Abcam，貨號(hào)：ab48581)；PCNA(F-2)抗體(Santa Cruz，貨號(hào)：sc-2528)；C3aR抑制劑(Santa Cruz，貨號(hào)：sc-222291)；早期生長(zhǎng)反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子-4(early growth response transcription factor 4, Egr4)抗體(Santa Cruz，貨號(hào)：sc-133540)；β-actin抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：H015)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年♂大鼠105只，SPF級(jí)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2015000509563，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SYXK(閩)2014-0005。

1.3儀器凝膠成像分析系統(tǒng) (Bio-Rad，型號(hào)：ChemiDoc XRS+)；PCR 儀(Bio-Rad，型號(hào)：C1000)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher，型號(hào)：PrimoR)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒，型號(hào)DHP-9052)；快速混勻器(常州國(guó)華電器，型號(hào)SK-1)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組及給藥方法第1批：大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、模型組(MCAO)、紅景天苷給藥組(MCAO+Sal)，每組15只。造模成功后，分別腹腔注射生理鹽水或紅景天苷(100 mg·kg-1)，給藥2 d。取缺血側(cè)的腦組織，用于實(shí)驗(yàn)。第2批：大鼠隨機(jī)分成溶劑假手術(shù)組(sham)、C3aR抑制劑假手術(shù)組(C3aR+sham)、模型組(MCAO)、C3aR抑制劑模型組(C3aR+MCAO)、給藥組(MCAO+Sal)、C3aR抑制劑給藥組(C3aR+MCAO+Sal)，共6組，每組10只。側(cè)腦室注射C3aR抑制劑或空白溶劑后30 min內(nèi)，除假手術(shù)組外，其余均進(jìn)行MCAO造模。造模后，連續(xù)腹腔注射生理鹽水或紅景天苷(100 mg·kg-1)2 d，取缺血側(cè)腦組織用于實(shí)驗(yàn)。

2.2大鼠腦缺血/再灌注模型的制備♂健康的SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)至體質(zhì)量達(dá)280 g左右，禁食后，用2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉。仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，沿頸部正中剪開(kāi)皮膚，并且鈍性分離皮下組織，找到頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈以及頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并用動(dòng)脈夾封住頸內(nèi)動(dòng)脈。用眼科剪在頸總動(dòng)脈距血管分叉5 mm處的管壁上剪一個(gè)小口，插入線(xiàn)栓，使線(xiàn)栓由頸總動(dòng)脈經(jīng)過(guò)分叉進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈約18～20 mm，結(jié)扎頸總動(dòng)脈。栓塞2 h后，將線(xiàn)栓從頸內(nèi)動(dòng)脈抽出，實(shí)現(xiàn)再灌注。而假手術(shù)組不插入線(xiàn)栓，其余步驟與模型組相同。整個(gè)手術(shù)過(guò)程保持溫度在37℃，以維持大鼠的體溫[6]。

2.3側(cè)腦室注射C3aR抑制劑大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，剪開(kāi)大鼠的頭皮，用定位儀定位：前鹵旁開(kāi)2.0 mm，后下1.5 mm。用顱骨鉆在此位置打孔后，用微量進(jìn)樣器經(jīng)由此孔定位于腦膜下方3.5 mm。靜置適應(yīng)5 min后，以0.5 mL·min-1的速率注射C3aR抑制劑或溶劑，C3aR抑制劑注射量為1 mg·kg-1。側(cè)腦室注射后30 min內(nèi)進(jìn)行MCAO造模[7]。

2.4神經(jīng)功能評(píng)分Zea-longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分為正常，無(wú)腦損傷；1分為不能完全伸展側(cè)前肢；2分為行走時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分向一側(cè)轉(zhuǎn)圈行走時(shí)摔倒；4分為不能行走，意識(shí)喪失。MCAO造模后2 h時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，≥2分模型成功[8]。

2.5腦組織中C1、C3、Egr4和NeuN蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)提取缺血側(cè)大腦總蛋白以及核蛋白，用SDS-PAGE電泳將蛋白分離后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。 5% BSA封閉2 h后，用稀釋后的一抗4℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌3次，每次10 min。加入稀釋1 000倍的二抗稀釋液室溫孵育2 h，再用TBST洗滌3次，每次10 min。加ECL試劑，用凝膠成像系統(tǒng)顯影，得到目標(biāo)蛋白的灰度值，計(jì)算各組之間的差異。

2.6腦組織中Egr4、C1qa、NeuNmRNA表達(dá)水平的檢測(cè)用RNeasy?MiNi Kit提取腦組織總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)Egr4、C1qa基因的表達(dá)量。反應(yīng)條件為50℃ 2 min，95 ℃預(yù)變性15 s，退火60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算2-△△Ct值。參照GenBank中大鼠的Egr4、C1qa的引物序列，Egr4的上游引物5′-AAGCTGGAGCAGGAAGAGGTTG-3′，下游引物5′-GCAGGGAGGAGGTTTTGGATAG-3′，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為161 bp。C1qa的上游引物5′-AACGACTACAACGGCATGGTG-3′，下游引物5′-TGAGTGAGGATGGGGAAAGCA-3′，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為141 bp。GAPDH的上游引物5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游引物5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT -3′，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為96 bp。

3 結(jié)果

3.1紅景天苷對(duì)MCAO模型大鼠缺血側(cè)C3、NeuN表達(dá)的影響MCAO造模1、2 d后，模型組C3均有明顯上升，NeuN表達(dá)明顯下降。紅景天苷給藥后，可使C3的表達(dá)明顯下降，NeuN的表達(dá)上升，且差異具有顯著性(P<0.05)。對(duì)C3以及NeuN的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大鼠造模1、2 d后，與假手術(shù)組相比，模型組的C3表達(dá)明顯上升，而NeuN的表達(dá)明顯下降，經(jīng)由紅景天苷處理之后，可逆轉(zhuǎn)C3以及NeuN的蛋白量表達(dá)，差異具有顯著性(P<0.01)，見(jiàn)Fig 1、2。

3.2紅景天苷對(duì)MCAO模型大鼠缺血側(cè)Egr4、C1qa表達(dá)的影響為了確定最佳的時(shí)間點(diǎn)，分析1 d以及2 d的Egr4和C1qa mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明，給予紅景天苷1 d對(duì)Egr4和 C1qa的表達(dá)并沒(méi)有明顯的影響，但給藥2 d能明顯升高Egr4，降低C1qa的mRNA表達(dá)，且差異均具有顯著性(P<0.01)，見(jiàn)Fig 3。

3.32d側(cè)腦室注射C3aR抑制劑和給予紅景天苷對(duì)C3a、Egr4、NeuN表達(dá)的影響由“3.2”結(jié)果得出，紅景天苷對(duì)經(jīng)典途徑的抑制作用在2 d后，因此，該實(shí)驗(yàn)選用2 d的MCAO大鼠模型，給予紅景天苷以及C3aR抑制劑。結(jié)果表明，與MCAO組大鼠相比，經(jīng)過(guò)2 d的紅景天苷以及C3aR抑制劑的分別作用，明顯降低了C3a的表達(dá)，并明顯增加NeuN、Egr4的表達(dá)，且差異均具有顯著性(P<0.01)，見(jiàn)Fig 4。

Fig 1 Salidroside reduced C3 and increased NeuN in peri-infarcted area (×400) #P<0.05, ##P<0.01 vs sham; *P<0.05 vs MCAO

Fig 2 Salidroside inhibited protein expression of C3(A,C) and enhanced protein expression of NeuN(B, D)(n=3)

##P<0.01vssham;**P<0.01vsMCAO

Fig 3 Differential effects of salidroside on Egr4(A) andC1qa(B) mRNA after 1d and 2d ischemic/reperfusion injury (n=3)

##P<0.05vssham;**P<0.01vsMCAO

4 討論

補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心，也是經(jīng)典途徑、旁路途徑以及凝集素途徑的中樞分子，C3的活化是放大補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。而C1是激活經(jīng)典途徑的啟動(dòng)子[8]，當(dāng)C1被激活后，經(jīng)過(guò)一系列變化生成C3轉(zhuǎn)化酶，所形成的C3轉(zhuǎn)化酶將補(bǔ)體C3裂解為C3a、C3b，從而產(chǎn)生炎癥。Egrs為早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因，包含Egr1、Egr2、Egr3、Egr4。該家族都具有1個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，可與DNA中的啟動(dòng)子特異性結(jié)合，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中起到重要的作用[9-10]。Ludwig等[11]研究發(fā)現(xiàn)，K-Cl協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的近側(cè)啟動(dòng)子區(qū)域攜帶Egr4結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子激活MAPK/ERK通路，誘導(dǎo)Egr4表達(dá)時(shí)，會(huì)刺激K-Cl協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上調(diào)，從而影響未成熟神經(jīng)元。Mengozzi等[9]的研究表明，通過(guò)上調(diào)Egr1、Egr2或Egr4的表達(dá)，可減輕炎癥和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，治療腦缺血大鼠。NeuN是成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，僅神經(jīng)元成熟后表達(dá)，且直接參與神經(jīng)元的調(diào)節(jié)。隨著神經(jīng)元的成熟，NeuN的表達(dá)量逐漸增加，故其表達(dá)量可以反映神經(jīng)元的成熟程度[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，紅景天苷對(duì)Egr4的升高作用是在成功抑制C3以后，并且紅景天苷對(duì)經(jīng)典途徑的抑制是在2 d之后。也證明了紅景天苷在MCAO急性期不是通過(guò)抑制經(jīng)典途徑和升高Egr的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。有研究表明[13]，腦缺血/再灌注24 h后，可通過(guò)抑制凝集素途徑起到神經(jīng)保護(hù)的作用，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果恰好與之相吻合。因此，為探索紅景天苷對(duì)經(jīng)典途徑的作用，分別連續(xù)2 d給予紅景天苷或側(cè)腦室注射C3aR抑制劑，使得C3a明顯下降，進(jìn)一步測(cè)得Egr4和NeuN均明顯上升，表明了紅景天苷和C3aR抑制劑的作用相一致。同時(shí)，該結(jié)果提示了Egrs的表達(dá)與紅景天苷在亞急性期抑制經(jīng)典途徑的激活有關(guān)。

Fig 4 Salidroside inhibited protein expression ofC3a(A) and enhanced mRNA expression of Egr4 (B) andprotein expression of NeuN(C)

##P<0.01vssham;**P<0.01vsMCAO

綜上所述，紅景天苷對(duì)腦缺血/再灌注亞急性期的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活，調(diào)控Egrs，從而減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。

(致謝: 本實(shí)驗(yàn)在福建省中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助與支持。)

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EffectsofsalidrosideonexpressionofNeuNandEgr4inischemicsideofMCAOratsbyinhibitingexpressionofC3

SONG Bai-ying, LAI Wen-fang, SU Yan-qing, LIN Yu, XU Wen, HONG Gui-zhu

(CollegeofPharmacy,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China)

AimTo investigate the effects of salidroside on NeuN and Egrs in the ischemic side of middle cerebral artery occlusion (MCAO) rats by inhibiting complement C3.MethodsThe rats were subjected to MCAO with suture-occluded method, and the neurologic injury was evaluated. The rats underwent 1h ischemia/reperfusion with 1d and 2d salidroside treatment, and the expressions of NeuN, Egr4, C3 and C1 were tested. Male Sprague Dawley rats were separately injected ventricle C3aR inhibitor and artificial cerebrospinal fluid with the help of ventricle stereotaxic apparatus. Thirty min later, the models of MCAO were finished with 1h reperfusion, drug administration and intracerebroventricular injection for 2d. The expressions of NeuN, Egr4, C3 were detected.ResultsCom-pared with models of MCAO, the expression of C3 in MCAO rats treated with salidroside 1d and 2d decreased significantly, and the expression of NeuN increased markedly. Salidroside had no apparent effect on Egr4 and C1 of administration of 1d, but it could significantly enhance the expression of Egr4 after 2d, and reduce the expression of C1 significantly after 2d. The rats administrated with C3aR inhibitor into cerebral ventricle continueously showed the same result in accordance with the treatment of salidroside. And the treatment of salidroside and C3aR inhibitor did not show remarkable additive effects.ConclusionThe neuroprotective effect of salidroside on acute cerebral ischemia/reperfusion injury may be related to the inhibition of the activation of the classical pathway of complement, the regulation of Egrs and the reduction of apoptosis.

salidroside; cerebral ischemia-reperfusion; complement C3; C3aR inhibitor; Egrs; neuroprotection

A

1001-1978(2017)11-1579-06

R-332；R284.1；R322.81；R392.11；R743.310.22

時(shí)間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.040.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.020

2017-07-20,

2017-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81603323，81473382)

宋百穎( 1990-)，女，碩士，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，E-mail：422039332@qq.com； 洪桂祝( 1966-)，女，博士，教授，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: laiwenfang08@ 163.com