基于UHPLC/Q-TOF/MS分析羊耳菊有效組分的入血成分

鞏仔鵬，陳亭亭，侯靖宇，吳林霖，李 梅，李月婷，陳思穎，蘭燕宇

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1. 貴州省藥物制劑重點實驗室、2. 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心、3. 藥學(xué)院、4. 國家苗藥工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

◇中藥藥理學(xué)◇

基于UHPLC/Q-TOF/MS分析羊耳菊有效組分的入血成分

鞏仔鵬1,2,3,4，陳亭亭1,2,3,4，侯靖宇1,2,3,4，吳林霖1,2,3,4，李 梅1,2,3,4，李月婷1,2,3,4，陳思穎1,2,3,4，蘭燕宇1,2,3,4

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1. 貴州省藥物制劑重點實驗室、2. 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心、3. 藥學(xué)院、4. 國家苗藥工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

目的應(yīng)用UHPLC/Q-TOF/MS技術(shù)和血清藥物化學(xué)研究手段，分析檢測羊耳菊有效組分的入血成分。方法大鼠灌胃給予羊耳菊有效組分提取物后，腹主動脈抗凝采血，血漿經(jīng)甲醇二次沉淀蛋白處理。采用Eclipse Plus C18RRHD色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)做流動相梯度洗脫，流速0.3 mL·min-1。負離子檢測模式，同時結(jié)合布魯克道爾頓公司的Metabolite Tools軟件，鑒定和表征其血中的移行成分。結(jié)果給藥后，在大鼠血漿中共檢測到16個代謝產(chǎn)物，包括9個原型成分和7個代謝物，代謝方式主要以咖啡酰基奎寧酸類化合物的異構(gòu)化、甲基化及甲基葡萄糖醛酸化的復(fù)合反應(yīng)為主。結(jié)論本研究較為全面地闡釋了羊耳菊活性部位提取物在大鼠血中的入血成分，為進一步研究羊耳菊藥材的體內(nèi)過程和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定的參考。

羊耳菊；血漿；入血成分；UHPLC/Q-TOF/MS；血清藥物化學(xué)；代謝物

羊耳菊(Inulacappa) 為貴州苗族常用藥材，苗族名“Bex nioux dant”(近似譯為“白牛膽”)，常用于病毒性感冒、癰瘡、乳癰、風(fēng)濕疼痛等癥，收載于《苗族醫(yī)藥學(xué)》、《中國民族藥志》等著作[1-2]。國內(nèi)外文獻報道的羊耳菊藥材主要成分有木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸乙酯苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-5-O-β-D-葡萄糖苷等黃酮類[3]、1,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、1,3,5-O-三咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸甲酯、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸甲酯、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸乙酯、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸乙酯、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸等酚酸類[4]，以及香豆素、揮發(fā)油等[5]。近年來，對羊耳菊及其制劑的抗炎、抗微生物、抗病毒藥理活性[6-7]也有部分報道，但對于其在體內(nèi)的直接活性物質(zhì)基礎(chǔ)并未有明確闡釋。在中藥復(fù)雜成分的研究中，普遍認為，中藥只有被吸收入血的成分才有可能是中藥發(fā)揮藥效的活性成分，因此，準確快速分析中藥口服入血成分，也是深入研究中藥作用機制的重要基礎(chǔ)[8]。本文采用UHPLC/Q-TOF/MS法，結(jié)合血清藥物化學(xué)實驗方法，對大鼠給藥后的血漿樣品進行檢識，比較分析空白血漿、含藥血漿和差異圖譜，結(jié)合相關(guān)代謝軟件和對照品，對所得代謝物進行結(jié)構(gòu)確認，推測出羊耳菊有效組分中主要化合物可能的代謝途徑，為羊耳菊藥材的體內(nèi)過程研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1儀器超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統(tǒng)，布魯克道爾頓四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀)；Allegra 64R低溫高速離心機(Beckman Coulter)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)。

1.2藥物與試劑木犀草苷、綠原酸對照品(批號：111720-201408、110753-201415)均購于中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸、隱綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對照品(批號：X20-20141012、Y58-20141012、1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215)均購于中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心；羊耳菊藥材購自貴州龍里縣，由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊Inulacappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的干燥全草。

1.3實驗動物健康SD大鼠，♀♂兼用，體質(zhì)量為(250±20) g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK (渝)2015-0001。

2 方法

2.1色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8μm)；柱溫：40℃；流動相：0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)；進樣體積為5 μL。梯度洗脫條件：0～1 min，5%～10%(A)；1～13 min，10%～28%(A)；13～16 min，28%～100% (A)，16～17 min，100%～100%(A)，17～18 min，100%～5%(A)。

2.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源；掃描方式為正、負離子掃描(ESI+、ESI-，m/z 50～1 000)；毛細管電壓：ESI-(3.5 kV)、ESI+ (4 kV)；離子源溫度: 200℃；霧化氣(N2)壓力：1.2 bar；干燥氣溫度：200 ℃；氣體體積流量：6 L·min-1；準確質(zhì)量測定采用甲酸鈉校正標準液；校正模式選用：Enhanced Quadratic；數(shù)據(jù)分析：Data Analysis軟件、Metabolite Tools?、質(zhì)量虧損過濾(MDF)等。

2.3羊耳菊有效組分提取物的制備通過實驗室前期藥效學(xué)實驗篩選，確定羊耳菊有效組分的提取方式。取羊耳菊藥材12 kg，充分混勻，取10倍量體積分數(shù)為0.6的乙醇，提取3次，每次1 h，合并3次濾液，減壓濃縮，回收乙醇，得12 L濃縮液。上述濃縮液用D101大孔樹脂吸附(徑高比1 ∶4)，加水洗脫至流出液無顏色后，再用體積分數(shù)為0.6的乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，得浸膏，微波真空干燥即得，得膏率為7%。經(jīng)測定，羊耳菊提取物中東莨菪苷、木犀草苷、1,3-二咖啡酰基奎寧酸、3,4-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-二咖啡酰基奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量依次為0.29%、0.74%、2.01%、3.82%、3.56%、3.87%、2.17%、0.99%、3.36%。-4℃條件干燥保存，備用。

2.4供試液樣品的制備稱取提取物粉末1 g，精密稱定，加入10 mL體積分數(shù)為0.5的甲醇水，超聲10 min，15 000 r·min-1離心 10 min，取上清液即得，備用。

2.5標準品溶液的制備分別精密稱取綠原酸等8種對照品，于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容。得綠原酸(0.740 g·L-1)、新綠原酸(1.032 g·L-1)、隱綠原酸(1.026 g·L-1)、1,3-二咖啡酰基奎寧酸(1.064 g·L-1)、木犀草苷(1.014 g·L-1)、3,4-二咖啡酰基奎寧酸(1.032 g·L-1)、3,5-二咖啡酰基奎寧酸(1.194 g·L-1)、4,5-二咖啡酰基奎寧酸(1.204 g·L-1)的標準品溶液。置冰箱(-20 ℃)保存，備用。

2.6樣品處理方法取大鼠血漿1 mL，加入50 μL體積分數(shù)為0.001的甲酸水，加2 mL甲醇，渦混3 min，超聲5 min，15 000 r·min-1離心10 min，上清液于37℃下N2吹干，殘渣加入1 mL甲醇2次沉淀，最后殘渣加入200 μL 體積分數(shù)為0.5的甲醇水溶解，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液2 μL，進樣分析。

2.7空白血漿及含藥血漿樣品的制備健康SD大鼠6只，分組，給藥前禁食12 h，自由飲水。按照 10 mL·kg-1分別灌服蒸餾水和羊耳菊有效組分提取物(給藥劑量為100 g·kg-1生藥量)，每日2次， 連續(xù)給藥3 d，末次給藥后15 min每只大鼠腹主動脈采血，4℃、6 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，得空白和給藥血漿樣品。

3 結(jié)果

3.1UHPLC/Q-TOF/MS色譜采集根據(jù)建立的方法，對提取物樣品、空白血漿、血漿樣品進行分析，各成分在ESI-模式下得到信號響應(yīng)較好，同時Metabolite軟件得到空白血漿和血漿樣品的差異圖譜，各樣品總離子流圖見Fig 1。

Fig 1 Base peak chromatograms of Inula cappa extractmetabolites in plasma sample in negative mode

A: Blank plasma; B: Plasma sample; C: Different chromatograms of A and B; D:Inulacappaextract sample

3.2入血成分分析根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、同位素豐度比、分子碎片峰、對照品和提取物樣品色譜保留時間，結(jié)合以往文獻報道[9-12]，共檢測到16個代謝產(chǎn)物，其中包括9個原型成分，見Tab 1。

3.2.1原型成分分析 化合物M1～M5、M7～M9：保留時間分別為2.6、3.7、3.9、5.2、7.9、8.8、9.1、10.1 min。他們的準分子離子峰分別為m/z 353.0887[M-H]-、m/z 353.0862[M-H]-、m/z 353.0876[M-H]-、m/z 515.1175[M-H]-、m/z 447.0942[M-H]-、m/z 515.1193[M-H]-、m/z 515.1171[M-H]-、m/z 515.1180[M-H]-，保留時間和質(zhì)譜碎片分別與新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品一致，故確定M1～M5、M7～M8為原型成分新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1,3-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草苷、3,4-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-二咖啡酰基奎寧酸。

化合物M6：保留時間8.1 min，產(chǎn)生的準分子離子峰為m/z 461.0786 [M-H]-，丟失176 u后產(chǎn)生m/z 285.0477的碎片離子，與提取物中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷原型成分保留時間、分子式和碎片離子一致，故推測其可能為原型成分木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

3.2.2代謝產(chǎn)物分析 結(jié)合Metabolite Tools代謝物數(shù)據(jù)處理軟件，對代謝物可能的結(jié)構(gòu)和可能的代謝途徑進行推測，代謝物結(jié)構(gòu)列表見Tab 1。

M10～M12：保留時間分別為2.8、4.2、4.7 min。它們的準分子離子峰分別為m/z 353.089[M-H]-、m/z 353.0899[M-H]-、m/z 353.0878[M-H]-，裂解后產(chǎn)生的碎片離子分別為m/z 173.0518、m/z 191.0581、m/z 191.0526。雖然碎片離子與單咖啡酰基一致，但難以確定取代基位置，故推測M10～M12可能為單咖啡酰基奎寧酸發(fā)生酯基位置異構(gòu)而產(chǎn)生的。

M13～M15：保留時間為5.6、6.0、6.2 min，產(chǎn)生的準分子離子峰分別為m/z 367.1018 [M-H]-、m/z 367.1037[M-H]-、m/z 367.1042 [M-H]-，比單咖啡酰基奎寧酸多1個CH2，它們能裂解產(chǎn)生m/z 193.0506、m/z 193.0508、m/z 193.0496的碎片離子。m/z 193比咖啡酸負離子m/z 179多1個CH2，因此推測甲基結(jié)合位點在咖啡酸。故推測M13～M15均為單咖啡酰基奎寧酸的甲基化產(chǎn)物。

M16：保留時間為9.5 min，產(chǎn)生m/z 719.1823的準分子離子峰，經(jīng)過裂解后，中性丟失176 u，產(chǎn)生m/z 543.1493的碎片，說明該化合物為葡萄糖醛酸結(jié)合物，且m/z 543.1493比二咖啡酰基奎寧酸多1個C2H4，繼續(xù)丟失CH2，得到m/z 515.1191的碎片，說明存在兩個CH2，故推測化合物M16為二甲基化二咖啡酰基奎寧酸的葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。

3.3主要入血成分結(jié)構(gòu)和可能的代謝途徑分析羊耳菊有效組分在血漿中主要的代謝途徑可能為單咖啡酰基奎寧酸的酯鍵異構(gòu)和甲基化，由于取代基位置不能確定，且提取物中存在大量的單咖啡酰基奎寧酸和二咖啡酰基奎寧酸，故異構(gòu)化和甲基化的單咖啡酰基奎寧酸也可能是由二咖啡酰基奎寧酸水解而來。同時還存在二咖啡酰基奎寧酸的雙甲基葡萄糖醛酸化反應(yīng)，以綠原酸和3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸為例，推測它們可能的代謝途徑分別見Fig 2、3。

Fig 2 Possible biotransformation pathways of chlorogenic acid1: Methylate

Tab 1 Identification of metabolites of plasma of Inula cappa extract

Fig 3 Possible biotransformation pathways of 3,4-O-dicaffeoylquinic acid2: Hydrolyze; 3: Dimethylation; 4: Glucuronidation or glucosidation

4 討論

前期實驗室預(yù)實驗中，大鼠灌胃羊耳菊有效組分提取物后，分別考察5、15、30、45 min血清和血漿的質(zhì)譜信息，通過對不同樣品的色譜圖峰強度、峰數(shù)目及入血峰面積等結(jié)果進行對比，最終確定灌胃后的最佳采血時間點為15 min，且血漿樣品優(yōu)于血清。同時考察了乙腈、乙酸乙酯、甲醇等多種樣品處理方法，結(jié)果采用甲醇2次沉淀蛋白得到的樣品色譜圖信息量較大，干擾少。同時，預(yù)實驗中血漿處理時還考察了是否加酸，結(jié)果表明血漿處理加入50 μL體積分數(shù)為0.001的甲酸水后，所得到的入血成分更多，且響應(yīng)值有明顯提高。

大鼠灌胃羊耳菊有效組分提取物后，共檢測到9個原型成分，包括2個黃酮類成分和7個咖啡酰基奎寧酸類成分。通過與對照品比對，其中的8個成分分別是新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、木犀草苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸，通過質(zhì)譜碎片信息、保留時間與提取物對比，推測另一個黃酮類原型成分為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。且代謝產(chǎn)物僅檢測到單咖啡酰基奎寧酸的酯基位置異構(gòu)、甲基化產(chǎn)物和二咖啡酰基奎寧酸的甲基葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。因此，提示異構(gòu)化、甲基化和葡萄糖醛酸化是咖啡酰基奎寧酸類成分在大鼠體內(nèi)的3條重要代謝途徑。

有研究報道，綠原酸的5-位咖啡酰基在人體內(nèi)可以通過分子內(nèi)酯鍵轉(zhuǎn)移向3-和4-位轉(zhuǎn)化[13]，所以推測大鼠體內(nèi)的綠原酸等成分也發(fā)生了類似的轉(zhuǎn)移。單咖啡酰基奎寧酸類成分在大鼠體內(nèi)發(fā)生的甲基化反應(yīng)可能與體內(nèi)存在的兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyltransferas, COMT)有關(guān)，兒茶酚結(jié)構(gòu)中的間位羥基是COMT催化發(fā)生甲基化反應(yīng)的主要部位[14]。在代謝產(chǎn)物中檢測到的單咖啡酰基奎寧酸的甲基化和二咖啡酰基奎寧酸的雙甲基葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，與其底物相比，極性發(fā)生改變，這將有助于它們從膽汁和尿液中排出。

相關(guān)文獻報道，單咖啡酰基奎寧酸即綠原酸類成分，具有明顯的抗菌、抗病毒、抗炎、清除自由基、降血糖、降血脂等作用[15]。木犀草苷類黃酮成分，也具有保護心血管、抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化等作用[16]。因此，血漿中存在的綠原酸類成分及其酯基異構(gòu)化代謝產(chǎn)物和黃酮類成分，可能是體內(nèi)直接藥效物質(zhì)，有待進一步研究驗證。

大多數(shù)多酚類化合物都含有兒茶酚結(jié)構(gòu)，一般來說，兒茶酚結(jié)構(gòu)中的鄰二酚羥基容易被氧化成醌。已經(jīng)知道有很多藥物及內(nèi)源性的雌激素/兒茶酚胺在體內(nèi)會轉(zhuǎn)化成醌類物質(zhì)，它們通過誘導(dǎo)氧化還原循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生超氧化自由基，或通過與細胞的親核成分作用而發(fā)揮細胞毒作用[17]。但有些多酚類物質(zhì)并未在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成醌類物質(zhì)，而只發(fā)生甲基化反應(yīng)。在本實驗中，血漿中并未發(fā)現(xiàn)咖啡酰基類成分氧化成醌類物質(zhì)生成，說明這類成分可能是具有獨特代謝特點、毒副作用小的一類化合物。

本實驗采用UHPLC/Q-TOF/MS技術(shù)，對羊耳菊藥材口服后在大鼠血漿中可能的成分進行了初步分析，獲得的羊耳菊藥材中含量較高的咖啡酰基奎寧酸類成分的信息，對這類化合物的生物轉(zhuǎn)化以及對羊耳菊藥材的進一步藥理活性和藥代動力學(xué)研究具有重要的參考價值，也為中藥潛在活性物質(zhì)研發(fā)以及臨床應(yīng)用提供了重要的研究思路和理論參考。

(致謝：本實驗的研究工作是在貴州省藥物制劑重點實驗室完成，向幫助實驗的各位老師和同學(xué)致以最誠摯的謝意！)

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AnalysisofcomponentsinplasmafromeffectivefractionsofInulacappabasedonUHPLC/Q-TOF/MS

GONG Zi-peng1,2,3,4, CHEN Ting-ting1,2,3,4, HOU Jing-yu1,2,3,4, WU Lin-lin1,2,3,4, LI Mei1,2,3,4, LI Yue-ting1,2,3,4, CHEN Si-ying1,2,3,4,LAN Yan-yu1,2,3,4

[1.GuizhouProvincialKeyLabofPharmaceutics, 2.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM(MinistryofEducation), 3.SchoolofPharmacy, 4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao’sMedicines,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China]

AimTo analyze the main components of effective fractions ofInulacappain rat plasma with UHPLC/Q-TOF/MS technology and serum pharmacochemistry theory.MethodsAfter gavage administration withInulacappaextracts, blood was collected from abdominal aorta, and the protein in plasma sample was precipitated by methanol. Eclipse Plus C18RRHD (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) was used, with 0.1% formic acid agueous solution(A)-0.1% formic acid and acetonitrile (B) as the mobile phase for gradient elution, and the flow rate was 0.3 mL·min-1. Detected at negative ion mode, and with the help of Metabolite Tools software from Bruker Corporation, components in plasma were defined.ResultsA total of 16 compounds were identified, including 9 prototypes and 7 metabolites. Main metabolites were isomerization, methylation, glucuronidation and recombination of caffeoylquinic acid.ConclusionsTherefore, our study has comprehensively expoundedInulacappaextracts’ constituents migrating to rat plasma, and provided a reference for further studies forinvivometabolic process and effective material base ofInulacappa.

Inulacappa; plasma; effective fraction; UHPLC/Q-TOF/MS; serum pharmacochemistry; metabolites

A

1001-1978(2017)11-1605-06

R-332；R282.71；R284.1；R289.5；R446.11；R969.1

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.050.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.025

2017-06-23,

2017-07-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81360680)；貴州省優(yōu)青項目[黔科合人字(2015)11號]；貴州省教育廳“民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用產(chǎn)學(xué)研基地建設(shè)”項目(黔科合KY字[2013]122)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目[黔科合LH字(2015)7362]；貴州省研究生卓越人才計劃項目(黔教研合ZYRC字[2014]012)；貴州省中醫(yī)藥管理局項目(No QZZY-2015-078)

鞏仔鵬(1985-)，男，博士，副教授，研究方向：中藥藥代動力學(xué)，Tel：0851-86908468，E-mail: gzp4012607@126.com; 蘭燕宇(1958-)，女，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及新藥開發(fā)，通訊作者，Tel： 0851-6908899， E-mail: yanyu626@126.com